Una deleción única de lisina Myh11 causa disección aórtica al reducir la integridad estructural y la contractilidad de la aorta.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 8844 (2022) Citar este artículo

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Las variantes patogénicas de la cadena pesada de miosina (Myh11) causan aneurismas y disecciones de la aorta torácica familiares (FTAAD). Sin embargo, los mecanismos patológicos subyacentes siguen sin estar claros debido a la falta de modelos animales. En este estudio, establecimos un modelo de ratón con Myh11 K1256del, la variante patogénica que encontramos previamente en dos familias FTAAD. La aorta Myh11∆K/∆K mostró un aumento del grosor de la pared y anomalías ultraestructurales, incluida una adhesión celular debilitada. En particular, los ratones Myh11∆K/+ desarrollaron disecciones aórticas y hematomas intramurales cuando se estimularon con angiotensina II. Mecánicamente, la subunidad alfa2 de la integrina (Itga2) estaba regulada negativamente en las aortas Myh11∆K/∆K, y las células del linaje de células del músculo liso que se diferenciaban de Myh11∆K/∆K inducían células madre pluripotentes. También se redujo la contractilidad de las aortas Myh11∆K/∆K en respuesta a la fenilefrina. Estos resultados implican que la adhesión celular subóptima indicada por la regulación negativa de Itga2 provoca un defecto en la contracción de la aorta. En consecuencia, la contracción defectuosa puede aumentar el estrés hemodinámico subyacente a las disecciones aórticas.

Al menos el 20% de los pacientes con enfermedad de la aorta torácica sin características sindrómicas tienen un familiar afectado de primer grado, conocido como aneurismas y disecciones de la aorta torácica familiar (FTAAD)1,2,3. Se han identificado cuatro genes patógenos asociados con la función contráctil del músculo liso (ACTA2, MYH11, MYLK y PRKG1)4,5,6,7. Aunque la FTAAD es una enfermedad de la aorta torácica no sindrómica, los pacientes con variantes patogénicas en esos genes presentan fenotipos aórticos similares a los de las enfermedades sindrómicas de la aorta torácica8. MYH11 codifica la cadena pesada de miosina específica del músculo liso (SM-MHC), y las variantes patogénicas en MYH11 se informaron en el 2 % de las familias con FTAAD/ductus arterioso persistente (PDA)9. Las variantes patógenas se encuentran principalmente en la región C-terminal del SM-MHC y se prevé que afecten la polimerización de filamentos gruesos4. La alteración genética en Myh11, incluso la variante rara o la variante con número de copias identificada en grandes poblaciones, altera la función citoesquelética y contráctil de las células del músculo liso (SMC) y aumenta el estrés intracelular in vitro, lo que lleva a la remodelación en la enfermedad de la aorta torácica10,11,12 . Sin embargo, la patogénesis de cómo la variante patogénica Myh11 conduce a la disección aórtica aún no está clara debido a la falta de modelos animales apropiados.

Recientemente, informamos una variante de deleción (K1256del) en MYH11, que altera la alineación de cuatro lisinas de K1253-K1256 en la región de la meromiosina ligera, y se conservó completamente en todas las especies en dos pedigríes japoneses FTAAD que eran independientes entre sí. otro13. En este estudio, desarrollamos un modelo murino de esta variante patógena Myh11 K1256del utilizando el sistema CRISPR-Cas9 para evaluar la patogénesis de FTAAD procedente de la variante patógena Myh11.

Para investigar los efectos patológicos de la variante de eliminación de Myh11 1256 K, intentamos introducir esta variante en ratones B6 utilizando el sistema CRISPR-Cas9, pero esta manipulación genética resultó en letalidad embrionaria. La causa de la letalidad embrionaria no se investigó más a fondo. Para reducir los efectos fuera del objetivo del sistema CRISPR-Cas9, utilizamos ARNm de Cas9 (D10A) para generar cuatro ratones fundadores (Fig. 1B): tres heterocigotos (un macho y dos hembras) y un homocigoto macho (Fig. 1C). D). Las parejas reproductoras heterocigotas se utilizaron para generar homocigotos, pero no lograron criar a sus crías. La causa del abandono no fue estudiada y sigue siendo desconocida. El homocigoto fundador murió repentinamente a las cuatro semanas de edad (de causa incierta pero no de enfermedad aórtica). A continuación, recolectamos esperma del homocigoto muerto, que se utilizó para la fertilización in vitro y la transferencia de embriones con hembras B6. Como resultado, generamos cinco heterocigotos de la siguiente generación y los retrocruzamos más de tres veces. Posteriormente, se utilizaron para el análisis ratones de tipo salvaje (WT), heterocigotos (Myh11∆K/+) y homocigotos (Myh11∆K/∆K) obtenidos mediante cruce de líneas. Los genotipos de todos los ratones se determinaron mediante un análisis de secuencia de ADN del sitio genéticamente modificado (Fig. 1E).

Generación de ratones Myh11 (Δ1256K) basada en CRISPR/Cas9. (A) Secuencia del exón 28 de Myh11 murino al que se unen gRNA1 y 2 y un sitio de direccionamiento del donante de ADN Myh11 (Δ1256K). El sitio de secuencia PAM y PAM modificado en el fragmento donante de ADN Myh11 (Δ1256K) se indican en rojo y verde, respectivamente. Las ubicaciones de los cebadores de PCR se indican con flechas. (B) Tabla que resume el número (n°) de cigotos inyectados, no. cigotos transferidos y no. Se muestran los cigotos desarrollados hasta el término. El no. También se muestra el número de cachorros que muestran knock-in. (C) Secuencias alrededor del sitio objetivo Myh11 en muestras de tipo salvaje (WT) y knock-in (núms. 16, 20, 22 y 24). El panel superior muestra secuencias con la eliminación de AAG sola y aquellas en las que ambas secuencias de PAM (rojas) se cambiaron a secuencias de PAM modificadas (verde) en las muestras numeradas 16, 20 y 24. El panel inferior muestra las secuencias que muestran la eliminación de AAG sola y aquellos en los que solo una secuencia PAM reconocida por gRNA1 (rojo) se cambió a secuencias PAM modificadas (verde) reconocidas por gRNA1 en la muestra numerada 22. (D) Secuencias de aminoácidos alrededor del sitio objetivo Myh11 de WT y muestras knock-in (núms. 16, 20, 22 y 24). Tenga en cuenta que las secuencias de todas las crías knock-in son las mismas que las de las crías WT, excepto por la ausencia de lisina (K) en las crías knock-in. El rojo muestra los aminoácidos correspondientes a las secuencias WT PAM. El verde muestra aminoácidos correspondientes a secuencias PAM modificadas. El no. Se seleccionó la línea 22 con secuencias WT PAM reconocidas por gRNA2 para análisis adicionales porque sus alelos están cerca del alelo WT Myh11. El no. La línea 22 se retrocruzó con el fondo B6 pasando 2 generaciones. (E) Genotipado Myh11 (Δ1256K) del no. 22 línea mediante secuenciación directa de productos de PCR correspondientes al sitio diana Myh11. La línea azul muestra AAG × 4, la línea roja muestra AAG × 3 y la flecha muestra el inicio de los ideogramas de error.

Las hembras Myh11∆K/+ quedaron preñadas normalmente y sus crías mutantes mostraron proporciones mendelianas; sin embargo, ocasionalmente ocurrieron problemas perinatales, como infanticidio y abandono. En las madres Myh11∆K/∆K, la muerte fetal era más probable que ocurriera que en WT (Figura complementaria 1A), e incluso las madres homocigotas a menudo morían durante el parto porque el tiempo de parto se prolongaba por más de 24 h (Figura complementaria 1B). . Debido a que generamos un número relativamente pequeño de machos Myh11∆K/∆K mediante apareamiento natural, utilizamos fertilización in vitro-transferencia de embriones para generar homocigotos para nuestros experimentos, y las madres sustitutas para la transferencia de embriones portaron y criaron a sus crías normalmente. Después del destete, las crías Myh11∆K/∆K crecieron normalmente y vivieron durante más de 18 meses sin disección aórtica (Figura complementaria 1C).

Para evaluar las características estructurales de las aortas Myh11∆K/∆K, extirpamos las aortas (ascendente, descendente y abdominal) de ratones WT, Myh11∆K/+ y Myh11∆K/∆K a las 12 semanas de edad (n = 5 ) para observación histológica. Las aortas Myh11∆K/∆K mostraron un aumento del espesor medial (WT frente a Myh11∆K/∆K, p <0,05) y adventicia engrosada (p <0,05), pero no una luz aórtica significativamente expandida (p = 0,30). Por el contrario, las aortas Myh11∆K/+ no mostraron ningún aumento estadísticamente significativo en el grosor de la media o la adventicia en comparación con las aortas WT (Fig. 2A, B y Fig. 2 complementaria). Ninguna de las regiones aórticas mostró una mayor tasa de disección en comparación con las otras regiones (Tabla complementaria 1).

Las aortas ascendentes Myh11∆K/∆K mostraron fenotipos de degeneración medial. (A) Arquitectura representativa de la pared aórtica (aorta ascendente, descendente y abdominal) de ratones WT y Myh11∆K/∆K de 12 semanas de edad. Las secciones transversales se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE), Elastica van Gieson (EVG, para elastina) y tricoma de Masson (MT, para colágeno; barras de escala = 50 µm, × 400). Las aortas Myh11∆K/∆K mostraron desgarros parciales de fibras elásticas y un aumento del espesor de la media y la adventicia. (B) Parámetros morfométricos de las aortas torácicas ascendentes WT, Myh11∆K/+ y Myh11∆K/∆K. La longitud de la circunferencia no difirió entre las aortas WT, Myh11∆K/+ y Myh11∆K/∆K (izquierda, n = 5), mientras que el grosor de la media (centro, n = 5) y el grosor de la adventicia (derecha, n = 5 ) de las aortas Myh11∆K/∆K aumentaron significativamente en comparación con las de las aortas WT. ** p < 0,01, ANOVA unidireccional con prueba post-hoc de Tukey. (C) Aspecto macroscópico de un vaso de derivación entre el arco distal y la arteria pulmonar, considerado como conducto arterioso permeable (CAP), en ratones Myh11∆K/∆K de 12 semanas de edad.

En todos los ratones Myh11∆K/∆K disecados, se observó un vaso sanguíneo de derivación que conecta el arco aórtico distal y la arteria pulmonar (Fig. 2C) y se parecía al PDA, que frecuentemente se asocia con FTAAD. Además, se observaron agrandamiento de la vejiga, riñones hinchados que indican hidronefrosis y úteros hipoplásicos en los ratones Myh11∆K/∆K (Figura complementaria 3A). En las vejigas Myh11∆K/∆K se observaron con frecuencia tinciones no uniformes, como perforaciones y espacios entre las capas de músculo liso (Figura complementaria 3B). Al cuantificar el grosor de las capas de músculo liso (miometria), observamos que el miometrio del útero Myh11∆K/∆K era más delgado que el del WT (Figuras complementarias 3C y D).

Para analizar las microestructuras aórticas, examinamos las aortas descendentes de ratones WT y Myh11∆K/∆K a las 18 semanas de edad mediante microscopía electrónica, suponiendo que cada región aórtica estaba igualmente predispuesta a la disección, ya que la aparición de la disección no estaba sesgada hacia una región específica. (Tabla complementaria 1). Los resultados revelaron una envoltura nuclear más delgada y numerosos componentes granulares en el núcleo mutante (Fig. 3A, fila superior), que aparecían en la morfología nuclear como eucromatina predominante y menos heterocromatina, lo que indica actividades transcripcionales activas. Estas características nucleares sugirieron un cambio latente del fenotipo contráctil al fenotipo sintético en una parte de las SMC mutantes. Las SMC Myh11∆K/∆K también mostraron una atenuación de la adhesión celular a otras células adyacentes y eran más grandes que las SMC WT (Fig. 3A, filas media e inferior). Además, detectamos algunas de las características que se observan a menudo en células muertas en SMC Myh11∆K/∆K. A menudo se observó un aumento de orgánulos en las SMC Myh11∆K/∆K, y ocasionalmente se detectaron desechos (Fig. 3B). También encontramos material osmiofílico en capas concéntricas, conocido como figuras de mielina, dentro o fuera de las SMC mutantes, que eran bastante raros en WT (Fig. 3C).

La microscopía electrónica a gran escala indicó un aumento del estrés intracelular, una disminución de la lámina de elastina y una adhesión celular atenuada en las aortas Myh11∆K/∆K. (A) Imágenes de microscopía electrónica de aortas descendentes WT y Myh11∆K/∆K+. Los núcleos Myh11∆K/∆K incluían una envoltura nuclear más delgada y muchos componentes granulares (fila superior, barras de escala = 1 µm, × 10,000). Las caras adhesivas entre las SMC en las aortas Myh11∆K/∆K+ eran más cortas que las de WT (fila central, barras de escala = 1 µm, × 12 000). El tamaño de las SMC en las aortas Myh11∆K/∆K+ fueron mayores que las de WT (fila inferior, barras de escala = 10 µm, × 2000). (B) Ocasionalmente se encontraron desechos en las aortas Myh11∆K/∆K (barras de escala = 1 µm, × 10,000). (C) Había figuras de mielina presentes dentro o fuera de las SMC Myh11∆K/∆K [barras de escala = 1 µm, × 12 000 (izquierda), × 20 000 (derecha)]. (D) La longitud adhesiva de las SMC en la aorta Myh11∆K/∆K fue significativamente más corta que en WT [n = 45 (15 células por muestra aórtica), WT 12,50 ± 8,16 µm/célula frente a Myh11∆K/ ∆K 7,28 ± 4,66 µm/celda, p < 0,01). (E) La proporción del área de las laminillas elásticas en la sección de 50 µm disminuyó en las aortas MYH11∆K/∆K en comparación con la de WT [n = 45 (15 de secciones de 50 µm por muestra aórtica), WT 0,29 ± 0,04 frente a Myh11∆K/∆K 0,23 ± 0,02, p < 0,01]. ** p < 0,01, prueba U de Mann-Whitney.

Para evaluar la integridad estructural de las aortas, analizamos más a fondo la adhesión celular y la lámina de elastina mediante el uso de imágenes completas de aortas transversales, que se obtuvieron a partir de imágenes de microscopía electrónica a gran escala. Medimos la longitud de las adherencias intercelulares de las SMC seccionadas longitudinalmente (Figura 4A complementaria; se proporciona un protocolo detallado en el material complementario en línea), y las adherencias intercelulares se acortaron significativamente en las aortas Myh11∆K/∆K (WT vs Myh11∆ K/∆K, p < 0,01, figura 3D). El área de laminillas elásticas, identificada como un área de textura simple (Fig. 4B complementaria; se proporciona un protocolo detallado en el material complementario en línea) también disminuyó en las aortas Myh11∆K/∆K (p <0,01, Fig. 3E). .

Teniendo en cuenta estas características morfológicas en las aortas Myh11∆K/∆K, planteamos la hipótesis de que Myh11 K1256del afecta negativamente la función del SMC. Para evaluar la contractilidad de las SMC en las aortas, medimos la fuerza isométrica de los anillos aórticos de ratones WT, Myh11∆K/+ y Myh11∆K/∆K a las 12 semanas de edad en respuesta a agonistas contráctiles y vasodilatadores. La fuerza desarrollada en respuesta a la fenilefrina disminuyó significativamente en la aorta torácica de los ratones Myh11∆K/∆K en comparación con la de los ratones WT (p <0,01, Fig. 4A). La fuerza máxima desarrollada en respuesta al tratamiento con fenilefrina o cloruro de potasio se redujo significativamente en la aorta Myh11∆K/∆K en comparación con la aorta WT (Fig. 4B). Esta contractilidad reducida en las SMC Myh11∆K/∆K puede contribuir a la disminución de la mecanoadaptación de la pared aórtica. Por el contrario, las funciones de vasodilatación en respuesta a la acetilcolina (para la vasodilatación dependiente del endotelio) o al nitroprusiato (para la vasodilatación independiente del endotelio) fueron comparables entre las aortas WT, Myh11∆K/+ y Myh11∆K/∆K (Fig. 4C). .

Myh11 K1256del función contráctil atenuada en SMC Myh11∆K/∆K. (A) Efecto de Myh11 K1256del sobre la contracción dosis-dependiente de aortas inducida por fenilefrina (Phe). Cada punto representa la media ± SEM. (B) Gráfico de puntos de dispersión que muestra las medias ± DE de la fuerza máxima que las aortas WT, Myh11∆K/+ y Myh11∆K/∆K produjeron después del tratamiento con fenilefrina (Phe) o KCl (WT y Myh11∆K/+: n = 5; Myh11∆K/∆K: n = 3). * p < 0,05, prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Dunn. (C) Tasa de relajación de la aorta descendente en respuesta a la acetilcolina (ACh) y al nitroprusiato de sodio (SNP) después de la respuesta contráctil a 10–5 mol/L de Phe (WT y Myh11∆K/+: n = 5; Myh11∆K /∆K: n = 3). No existe una diferencia significativa en la vasodilatación dependiente o independiente del endotelio entre las aortas WT y Myh11∆K/+.

La atenuación de la intensidad estructural y la mala adaptación al estrés mecánico en las aortas mutantes pueden predisponer a las personas a desarrollar disección de la aorta torácica. Para investigar los mecanismos patológicos de la disección aórtica asociados con Myh11 K1256del, administramos Ang II (1000 ng/kg/min) a machos WT (n = 16) y Myh11∆K/+ (n = 15) a las ocho semanas de edad con bombas osmóticas. La presión arterial sistólica se midió antes de la implantación de la bomba de infusión y después de dos semanas de tratamiento con Ang II. Los ratones tratados con Ang II mostraron un aumento en la presión arterial sistólica, pero no hubo diferencias significativas entre los ratones WT y Myh11∆K/+ (antes de las implantaciones: p = 0,97, después de los tratamientos: p = 0,96; Figura complementaria 5A). Con frecuencia se observó un pequeño hematoma intramural en la aorta Myh11∆K/+ torácica y abdominal (Figura complementaria 5B). Se produjeron disecciones aórticas en seis ratones Myh11∆K/+ (40,0%) y dos ratones (13,3%) murieron por roturas aneurismáticas. No hubo sesgo en los sitios de las disecciones aórticas entre las aortas Myh11∆K/+ torácica y abdominal (Figura complementaria 5C). Por el contrario, no se indujeron hematomas intramurales ni disecciones aórticas en ratones WT tratados con Ang II. También intentamos generar una cantidad suficiente de ratones Myh11∆K/∆K tratados con Ang II para su análisis, pero fue difícil obtener muestras aórticas porque la mayoría de los ratones murieron por roturas aneurismáticas. En un experimento preliminar, tres de cuatro ratones Myh11∆K/∆K tratados con Ang II murieron repentinamente entre dos y cuatro días después del inicio de la infusión. Disecamos estos ratones y encontramos una ruptura en la aorta ascendente o el arco aórtico (datos no mostrados). Histológicamente, las aortas Myh11∆K/+ tratadas con Ang II mostraron una fragmentación de las laminillas elásticas y depósito de tejido fibrótico y mostraron expansión luminal (Fig. 5A, B). No se observó una diferencia significativa en la expresión del receptor Ang II tipo 1 (AGTR1) en las aortas WT y Myh11∆K/∆K (Figura complementaria 5E).

La infusión de angiotensina II (Ang II) induce la disección aórtica en ratones MYH11∆K/+. (A) Imágenes patohistológicas de aortas descendentes de ratones WT y Myh11∆K/+ tratados con Ang II. Las secciones transversales se tiñeron con HE, EVG y MT (panel superior). La parte izquierda del panel muestra fragmentación elástica y depósito de tejido fibrótico en regiones no disecadas (barras de escala = 50 µm, × 400). (B) Circunferencia de las aortas torácicas ascendentes WT y Myh11∆K/+ después de dos semanas de infusión de Ang II. Peso: n = 14; Myh11∆K/+: n = 9. * p < 0,05, prueba U de Mann-Whitney.

Investigamos las expresiones de genes y proteínas de las aortas de machos WT y Myh11∆K/∆K a las 12 semanas de edad. Debido a que las características morfológicas en las SMC mutantes en la micrografía electrónica sugieren una transformación de un fenotipo contráctil a un fenotipo sintético en las SMC, analizamos la expresión de las isoformas SM (SM1 y SM2) en las aortas, que indican la diferenciación de las SMC14,15,16. Sin embargo, encontramos que los músculos lisos aórticos no sufren una modulación fenotípica general como se observa en las lesiones vasculares agudas porque la expresión de SM1 y SM2 en la aorta mutante no mostró ninguna anomalía en comparación con los ratones WT a las 12 semanas de edad (Fig. 6A, B). y figura complementaria 11). Para investigar más a fondo si la expresión o fosforilación de las proteínas implicadas en la contracción del músculo liso está alterada en las SMC Myh11∆K/∆K, medimos la expresión de estos genes mediante RT-qPCR y los niveles de proteína mediante inmunotransferencia. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre las aortas WT y Myh11∆K/∆K en la expresión de actina del músculo liso α (Acta2), SM-MHC (Myh11) y calponina (Cnn1) o en el nivel de luz reguladora de miosina. fosforilación de cadena (RLC) (Fig. 6C – F y Figs. Suplementarias 6A, 12). El nivel de fosforilación de la quinasa de adhesión focal (FAK), una molécula clave en las cascadas de señalización de la adhesión focal, también fue comparable entre las aortas WT y Myh11∆K/∆K (Fig. 6G y Figs. Suplementarias 6A, 13, 14) . La expresión de un marcador de proliferación, el antígeno nuclear de células proliferantes y la ciclina D1 también fueron comparables entre las aortas WT y Myh11∆K/∆K (Figura complementaria 6B). También investigamos la expresión génica de TGF-ß (Tgfb1) y los factores transcripcionales de su cascada posterior [factor de crecimiento del tejido conectivo (Ctgf), MMP2 (Mmp2) y MMP9 (Mmp9)], que están asociados con la patogénesis en TAD. pero no se observaron diferencias significativas en su expresión entre las aortas WT y Myh11∆K/∆K (Fig. 6C).

Expresión y fosforilación de proteínas en aortas Myh11∆K/∆K+. (A) La inmunotinción para SM1 y SM2 no mostró diferencias obvias en las expresiones y distribuciones entre las aortas ascendentes WT y Myh11∆K/∆K (barras de escala = 50 µm, × 400). (B) Análisis densitométrico de la expresión de SM1 y SM2 en aortas WT y Myh11∆K/∆K. Los niveles de expresión de proteínas se normalizaron con respecto a los de GAPDH (n = 5). La prueba U de Mann-Whitney mostró que la diferencia no fue estadísticamente significativa. (C) Análisis por RT-qPCR de ARNm de Acta2, Cnn1, Myh11, Tgfb1, Ctgf, Mmp2 y Mmp9 aislado de aortas torácicas de ratones WT y Myh11∆K/∆K+ a las 12 semanas de edad. Los niveles de expresión genética se normalizaron a Gapdh. La expresión génica no difirió significativamente entre las aortas WT y Myh11∆K/∆K (WT vs Myh11∆K/∆K+ n = 5, Acta2; p = 0,11, Cnn1; p = 0,73, Myh11; p = 0,06, Tgfb1; p = 0,41, Ctgf; p = 0,29, Mmp2; p = 0,53 y Mmp9; p = 0,41). (D) Análisis densitométrico de la expresión de αSMA en aortas WT y Myh11∆K/∆K. Los niveles de expresión de proteínas se normalizaron con respecto a los de GAPDH (n = 5). La prueba U de Mann-Whitney mostró que la diferencia no fue estadísticamente significativa. (E) Análisis densitométrico de la expresión de calponina en aortas WT y Myh11∆K/∆K. Los niveles de expresión de proteínas se normalizaron con respecto a los de GAPDH (n = 5). La prueba U de Mann-Whitney mostró que la diferencia no fue estadísticamente significativa. (F) Análisis densitométrico de la relación entre la cadena ligera reguladora de miosina (RLC) fosforilada y la expresión total de RLC en aortas WT y Myh11∆K/∆K (n = 5). La prueba U de Mann-Whitney mostró que la diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,222). (G) Análisis densitométrico de la relación entre la expresión de la quinasa de adhesión focal fosforilada (FAK) y la expresión total de FAK (n = 5). La prueba U de Mann-Whitney mostró que la diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,417).

Nos esforzamos por identificar el mecanismo por el cual la eliminación de Myh11 K1256 da como resultado la disección aórtica in vitro diferenciando las células madre pluripotentes inducidas por Myh11ΔK/ΔK (iPSC) en SMC. Primero establecimos iPSC a partir de fibroblastos embrionarios de ratón con la expresión estable de factores de Yamanaka (Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc) y evaluamos las iPSC Myh11ΔK/ΔK en cuanto a su comparabilidad con las iPSC WT (Figura complementaria 7A)17. El número de colonias positivas para fosfatasa alcalina no difirió significativamente (Figura complementaria 7B, C). Luego evaluamos la pluripotencia generando cuerpos embrioides (EB) mediante el método de la gota colgante y determinamos la diferenciación de tres linajes de cada genotipo. Como se muestra en la película complementaria, los WT EB produjeron células latiendo. Sin embargo, la mayoría de las células que crecieron a partir de las EB Myh11ΔK/ΔK no eran latientes ni adherentes, lo que sugiere que la variante patógena Myh11 K1256del perjudica el mantenimiento de la pluripotencia. Cada genotipo tuvo una morfología similar durante nueve días después de la transducción retroviral, pero las colonias Myh11ΔK/ΔK no mantuvieron su morfología y las células granulares comenzaron a aparecer en el pase 3 (Figura complementaria 8A). Luego transdujimos Nanog a los MEF además de los factores de Yamanaka. Sorprendentemente, la expresión forzada de Nanog junto con los factores de Yamanaka durante la reprogramación de células somáticas permitió que las iPSC Myh11ΔK/ΔK mantuvieran la morfología similar a ESC (Figura complementaria 8B).

Nanog se une a una región potenciadora del gen de la α-catenina humana (Ctnna2) (sitio web de GeneCards: http://www.genecards.org)18. La observación de que la potencia de las iPSC mejoró mediante la expresión forzada de Nanog nos impulsó a examinar los genes regulados negativamente en las aortas Myh11ΔK/ΔK que identificamos mediante análisis de secuenciación de ARN para determinar su participación en la adhesión celular utilizando la base de datos Gene Ontology (GO)19,20. Un examen de esas interacciones entre sí en la base de datos STRING21 reveló que Ctnna2 tenía el mayor número de interacciones con las moléculas relacionadas con la adhesión intercelular (Figura complementaria 9). Investigamos más a fondo la diferencia funcional entre las SMC WT y Myh11ΔK/ΔK induciendo la diferenciación de las iPSC en el linaje SMC mediante el cultivo de células en medios que contienen ácido retinoico sin el factor inhibidor de la leucemia. En el día 5 de diferenciación, las células no habían asumido una morfología similar a la de SMC (Fig. 7A). Myh11 se reguló positivamente independientemente del genotipo en el día 3 de diferenciación (Fig. 7B), lo que indica que las células se habían comprometido con el linaje SMC. La subunidad de integrina α2 (Itga2) estaba regulada negativamente en las aortas aneurismáticas de ratones knockout Smad4 específicos de SMC22, y un análisis de interacción proteína-proteína STRING mostró que Itga2 tenía el segundo mayor número de interacciones con las moléculas relacionadas con la adhesión focal que estaban reguladas negativamente en la aorta Myh11ΔK/ΔK (Figura complementaria 9). Las mediciones de la expresión de ARNm de Itga2 en las células del linaje SMC también mostraron una reducción significativa en la expresión de Itga2 en las células Myh11ΔK/ΔK (Fig. 7C).

Itga2 está regulado negativamente en las células del linaje SMC que se diferencian de las iPSC Myh11∆K/∆K. (A) Imágenes de contraste de fase de iPSC WT y Myh11∆K/∆K en el día 5 de diferenciación por ácido retinoico (barra de escala = 200 µm). (B) Análisis por RT-qPCR de iPSC aisladas de ARNm de Myh11 en los días 0 y 3 de tratamiento con ácido retinoico. Los niveles de expresión génica se normalizaron para 18s rRNA (n = 4, día 0: p = 0,9714; día 3: p > 0,9999). Prueba U de Mann-Whitney. RA = ácido retinoico. (C) Análisis por RT-qPCR de iPSC aisladas de ARNm de Itga2 en el día 3 de diferenciación por ácido retinoico. Los niveles de expresión génica se normalizaron para el ARNr 18s. *p < 0,05, prueba U de Mann-Whitney.

Generamos un nuevo modelo de ratón de FTAAD con alta reproducibilidad de disección aórtica y hematoma intramural mediante tratamiento con Ang II. Descubrimos que Myh11 K1256del conduce a fragilidad estructural y mala adaptación contra el estrés mecánico en las aortas al disminuir la composición de las láminas de elastina y la contractilidad de las SMC. Esta propiedad alterada de Myh11 K1256del aortas aumenta la asociación con el inicio de la disección aórtica.

Predecimos que el ensamblaje de los filamentos de miosina puede interrumpirse en presencia de K1256del según el modelado de la estructura molecular23. La miosina normalmente se divide en dos fragmentos: meromiosina pesada N-terminal (HMM) y meromiosina ligera C-terminal (LMM)24. HMM consta del dominio motor globular (S1) y la región en espiral que conecta S1 y LMM (S2). LMM forma un filamento grueso al entrelazarse con los LMM de otras moléculas de miosina. K1256 está ubicado en el lado N-terminal de LMM, y la secuencia de aminoácidos alrededor de K1256 adopta un patrón típico de una repetición de heptada compuesta de residuos hidrofóbicos en las posiciones primera (a) y cuarta (d) (Figura complementaria 10A). . Estos residuos hidrófobos son necesarios para formar una estructura en espiral proporcionando contactos hidrófobos entre dos cadenas pesadas25. La figura complementaria 10B muestra un modelo estructural de la región que contiene K1256 (1226-1288 residuos) de Myh11. Los residuos hidrófobos de WT, a excepción de V1242, se encuentran en la interfaz entre dos cadenas pesadas y entran en contacto entre sí, lo que sugiere que esta región puede formar una estructura en espiral. Por el contrario, los residuos hidrofóbicos ubicados en el lado C-terminal de K1256 están expuestos al exterior por la eliminación de K1256 porque los residuos giran 100 ° en la estructura de hélice α. Este cambio en la orientación de la cadena lateral probablemente altera la estructura en espiral ensamblada de manera estable por los contactos hidrófobos, lo que puede afectar parcialmente las funciones del HMM, como la formación de filamentos gruesos.

Las imágenes con microscopía electrónica a gran escala son útiles para observar de manera integral secciones de tejido; este es el primer ejemplo de aplicación de este método para analizar un órgano luminal. Encontramos una disminución significativa en el área de laminillas elásticas, lo que sugiere un adelgazamiento de las laminillas elásticas. Como ha demostrado un estudio previo de FTAAD, el adelgazamiento de las laminillas elásticas parece ser una modificación estructural común de las aortas con la variante patogénica que causa FTAAD6. Además, mediante microscopía electrónica de transmisión convencional, observamos características patológicas asociadas con respuestas celulares al estrés, como desechos y figuras de mielina. La expresión y distribución de las isoformas SM (SM1 y SM2), que son marcadores moleculares de diferenciación de SMC14,15,16, no mostraron cambios obvios en el mutante Myh11∆K/∆K. Esto sugiere que el músculo liso en Myh11 K1256del no sufre una modulación fenotípica extensa.

En este estudio, se desarrolló disección aórtica y hematoma intramural en ratones Myh11∆K/+ dentro de las dos semanas posteriores a la infusión de Ang II. En nuestro modelo, observamos una fuerza de contracción reducida del anillo aórtico después de la estimulación con fenilefrina o KCl. Esta observación concuerda con un informe anterior de contractilidad atenuada de SMC inducida por la variante de deleción en la porción de bastón y en el dominio motor de miosina11. La microscopía electrónica a gran escala también indicó una reducción en la integridad estructural de la pared aórtica. Además, la expresión del receptor de Ang II tipo 1 en la aorta Myh11∆K/∆K no fue significativamente diferente de la del WT, lo que sugiere que los ratones WT y Myh11∆K/∆K tenían un nivel comparable de sensibilidad a la Ang exógena. II. Un estudio previo ha demostrado que la aplicación de cloruro cálcico a la aorta junto con la infusión de Ang II puede provocar disección aórtica en ratones26. En el modelo, se propuso que el aumento del estrés hemodinámico debido al endurecimiento de la aorta causaba disección en aortas con resistencia reducida de la pared26. Por lo tanto, el estrés hemodinámico amplificado causado por la contracción atenuada podría haber causado en última instancia la disección aórtica.

La estabilización del citoesqueleto submembranoso se considera importante para el desarrollo eficiente de la fuerza de las SMC y se han propuesto dos vías de contracción del músculo liso27. Una vía implica la fosforilación de RLC de miosina, pero nuestro análisis de fosforilación de RLC mediante inmunotransferencia no indicó ninguna atenuación de esta vía en las aortas Myh11ΔK/ΔK. La otra vía implica la mecanotransducción en las uniones de adhesión focal27. Nuestra secuenciación de ARN de la aorta Myh11ΔK/ΔK mostró una regulación negativa del gen Itga2 que codifica la subunidad alfa 2 de la integrina (Itga2), que participa en la adhesión focal28 (relación Myh11ΔK/ΔK/WT (log2) = − 1,76). Independientemente de sus genotipos, las iPSC aumentaron la expresión de Myh11 después del cultivo con ácido retinoico durante tres días, lo que sugiere que la eliminación de K1256 no inhibió la diferenciación en SMC. La expresión de Myh11 fue comparable entre las células WT y Myh11∆K/∆K, pero la expresión de Itga2 fue menor en las iPSC Myh11∆K/∆K que en las iPSC WT. Las células recién diferenciadas mostraron una disminución en la expresión de Itga2, lo que indica que la regulación negativa de Itga2 detectada en la aorta Myh11ΔK/ΔK detectada mediante el análisis de secuenciación de ARN está causada directamente por la variante patógena Myh11 K1256del en lugar de una respuesta secundaria a defectos causados por la variante patogénica. . Esto implica un posible papel de Myh11 en la modulación de la adhesión focal a través de la regulación de la expresión de Itga2. Informes anteriores han indicado que el polimorfismo en Itga2 se asocia con accidente cerebrovascular isquémico y aterosclerosis coronaria29 y que Itga2 está regulado negativamente en el modelo de aneurisma aórtico inducido por la inactivación de Smad422. El presente estudio es el primero en informar una regulación negativa de Itga2 en la aorta en un modelo FTAAD.

Estudios previos de nuestro grupo, así como de varios otros grupos, han demostrado que las SMC primarias pierden rápidamente sus fenotipos originales cuando se cultivan in vitro15,30,31,32. Por lo tanto, no es probable que los estudios in vitro de SMC primarias representen eventos in vivo. Para obtener SMC cultivadas que se parezcan mejor a las SMC tisulares, establecimos iPSC e indujimos la diferenciación de las iPSC en SMC. Las iPSC que generamos a partir de MEF Myh11ΔK/ΔK con la expresión forzada de factores de Yamanaka también perdieron pluripotencia y la capacidad de autorrenovarse y permanecer indiferenciadas en cinco pasajes. Curiosamente, la expresión estable forzada de Nanog, junto con los factores de Yamanaka, mejoró la estabilidad de las iPSC Myh11ΔK/ΔK. Dado que se sabe que Nanog se une a una de las regiones potenciadoras de la α-catenina humana18, las capacidades de las iPSC para autorrenovarse, permanecer indiferenciadas y mantener la pluripotencia podrían haberse rescatado mediante la regulación positiva de la α-catenina y la posterior estabilización de la adhesión intercelular. . Nuestros datos de secuenciación de ARN de la aorta también mostraron una disminución en la expresión de Ctnna2 (relación Myh11ΔK/ΔK/WT (log2) = − 10,8), así como en algunos otros genes implicados en la adhesión intercelular. La base de datos STRING mostró que Ctnna2 que codifica la α-catenina interactuaba con el mayor número de moléculas relacionadas con la adhesión intercelular que estaban reguladas negativamente en las aortas Myh11ΔK/ΔK. Trabajos anteriores han demostrado que la α-catenina conecta la cadherina y la red de actomiosina y que la pérdida de la función de la α-catenina interrumpe la adhesión intercelular33. Además, se sabe que la α-catenina actúa como un mecanosensor33 que mejora la adhesión celular y promueve la reorganización de la actina en las uniones celulares33. En el futuro, un estudio que utilice aortas de ratones con sobreexpresión o knockout de Ctnna2 puede revelar la participación de la α-catenina en la estabilización del citoesqueleto submembranoso y su contribución a la contracción aórtica. Además, aumentar la expresión de α-catenina podría ser una intervención eficaz para mejorar la adhesión intercelular y puede ser una estrategia novedosa para el tratamiento de FTAAD.

Finalmente, las señales mecánicas se transmiten mediante tres mecanismos. Las señales mecánicas de (1) la adhesión focal se transmiten a (2) la unión de adhesión intercelular a través de (3) la red de actomiosina34. Desde la unión de adhesión intercelular, las señales se transmiten a las células vecinas34. En este estudio, encontramos cambios genéticos y fenotípicos que apuntan a defectos en los tres mecanismos de nuestro modelo FTAAD. Mostramos la posibilidad de adhesión focal atenuada. Itga2, que participa en la adhesión focal, está regulada negativamente tanto en las aortas Myh11ΔK/ΔK como en las células que se diferencian en el linaje SMC. Luego, obtuvimos anomalías ultraestructurales mediante microscopía electrónica a gran escala que sugerían una adhesión intercelular defectuosa. Además, se redujo la expresión de genes, como Ctnna2 que codifica la α-catenina, que regulan la adhesión intercelular. Predecimos, según el análisis estructural (Figura 10 complementaria), que la estructura en espiral de la molécula de miosina II Myh11 K1256del no es óptima; por tanto, esta estructura puede atenuar la formación de la red de actomiosina. Por lo tanto, sospechamos que Myh11 K1256del causa un defecto en los tres mecanismos mencionados anteriormente y que todos contribuyen a la contractilidad reducida de las aortas Myh11ΔK/ΔK. Señalamos la importancia de probar la integridad de los tres mecanismos y monitorear la contractilidad de la red SMC en lugar de centrarse en la disfunción de los músculos lisos individuales. Cuando desarrollemos una nueva estrategia terapéutica para mejorar la contractilidad de las SMC, puede ser esencial abordar los tres mecanismos.

Aunque la atenuación de la contractilidad del SMC no condujo a la expansión luminal en la aorta Myh11∆K/∆K, el útero mostró una marcada dilatación con una pared más delgada. Además, la muerte fetal fue significativamente más frecuente en las madres Myh11∆K/∆K en comparación con las madres WT, lo que respalda que Myh11 desempeña un papel en la contracción uterina. También observamos PDA en todos los ratones Myh11∆K/∆K, mientras que pocos ratones Myh11∆K/+ exhibieron PDA. La contracción inadecuada del conducto arterioso en respuesta al oxígeno puede inducir PDA en ratones Myh11∆K/∆K. En comparación con modelos animales previamente informados con PDA que murieron dentro de las 24 h posteriores al nacimiento35,36,37,38, la mayoría de los ratones Myh11∆K/∆K sobrevivieron durante más de 18 meses con PDA, lo que sugiere que estos ratones son un modelo animal único de larga duración. supervivencia con CAP.

En resumen, Myh11 K1256del induce estrés patógeno en la pared aórtica mediante la inducción de fragilidad estructural y un trastorno de mecanoadaptación en la aorta. Estos cambios pueden ser causados por defectos en la adhesión focal, la adhesión intercelular y la red de actomiosina. Se necesitan más estudios para comprender el vínculo entre la estructura anormal de LMM y la regulación negativa de los genes que forman adherencias focales y adherencias intercelulares, ya que este conocimiento es fundamental para desarrollar una terapia preventiva para FTAAD.

En los datos complementarios se proporciona una descripción detallada de la metodología.

Los ratones C57BL/6 J con la variante salvaje o patogénica en Myh11 se mantuvieron bajo un horario de luz/oscuridad de 12 h (luces encendidas de 07:00 h a 19:00 h). Antes de procedimientos invasivos como la implantación de una bomba de infusión, los ratones fueron anestesiados mediante una única inyección intraperitoneal de una mezcla de cloruro de medetomidina (0,3 mg/kg), midazolam (4 mg/kg) y tartrato de butorfanol (5 mg/kg). 39. La ausencia del reflejo pedaleador se utilizó como indicador de anestesia profunda. Antes de tomar muestras de los tejidos de los ratones, se les practicó la eutanasia mediante una única inyección intraperitoneal de una sobredosis de pentobarbital sódico (100 mg/kg). Todos los procedimientos de manipulación de animales en este estudio cumplieron con la Guía para animales de laboratorio de Jichi Medical University, la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (Publicación NIH, octava edición, 2011) y las pautas ARRIVE40. El Comité Institucional de Atención y Cuidado de Animales de la Universidad Médica de Jichi aprobó todos los protocolos experimentales. A excepción del análisis histológico del útero, en este estudio se utilizaron ratones macho.

El ARNm de Nickase Cas9 [también conocido como Cas9 (D10A)41] se obtuvo utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T3 (Ambion) y pBS-NFCas9 (D10A)A linealizado con Sap I como plantilla de síntesis de ARN. Este plásmido pBS-NFCas9 (D10A)A se construyó reemplazando GAT [que codifica el ácido aspártico (D) en el décimo aminoácido de la proteína Cas9] con GCT [que codifica la alanina (A)] en el plásmido pBS-NFCas9A15 usando el proceso inverso. Método de PCR. La fidelidad de la secuencia de nucleótidos en la porción intercambiada se confirmó mediante secuenciación.

Los ARN guía (ARNg) dirigidos a Myh11 (NM_001161775.1) se prepararon como lo describen Sakurai et al.42 y se denominaron ARNg1 y 2 (Fig. 1A y Tabla complementaria 2). Se construyó un fragmento de ADN donante Myh11 de 220 pares de bases, en el que se eliminó AAG (que codifica lisina) en el aminoácido 1256 de la proteína MYH11, mediante un método de síntesis química de genes (TaKaRa Bio) y se denominó Δ1256K. En Δ1256K, la secuencia correspondiente a PAM se cambió a secuencias correspondientes a las reconocidas tanto por gRNA1 como por 2 (Fig. 1A y Tabla complementaria 2). Luego, este fragmento Δ1256K se clonó en el plásmido pMD20 (TaKaRa Bio). Tras la microinyección, el fragmento donante de ADN Δ1256K se eliminó del esqueleto del plásmido mediante digestión con BamHI y NdeI.

Para investigar los efectos patológicos de la variante de eliminación de Myh11 1256 K, intentamos introducir esta variante en ratones B6 utilizando el sistema CRISPR-Cas9 estándar (gRNA 1 y donante de ADN Δ1256K (Fig. 1A)), pero esta manipulación genética resultó en letalidad embrionaria. No estudiamos más a fondo la causa de la letalidad embrionaria, pero especulamos que puede ser causada por los indeles en Myh11 que conducen a una pérdida total de función o efectos fuera del objetivo. Por lo tanto, utilizamos el sistema CRISPR-nickase Cas9 (dos gRNA y un donante de ADN Δ1256K (Fig. 1A)) para generar cuatro ratones fundadores (Fig. 1B): tres heterocigotos (un macho y dos hembras) y un homocigoto macho (Fig. 1C, D). Las parejas reproductoras heterocigotas se utilizaron para generar homocigotos, pero no lograron criar a sus crías por razones desconocidas. La causa del abandono no fue estudiada y sigue siendo desconocida. El homocigoto fundador murió repentinamente a las cuatro semanas de edad (de causa incierta pero no de enfermedad aórtica). A continuación, recolectamos esperma del homocigoto muerto, que se utilizó para la fertilización in vitro y la transferencia de embriones con hembras B6. Como resultado, generamos cinco heterocigotos de la siguiente generación y los retrocruzamos más de tres veces. Posteriormente, se utilizaron para el análisis ratones WT, heterocigotos (Myh11∆K/+) y homocigotos (Myh11∆K/∆K) obtenidos mediante cruce de líneas. Los genotipos de todos los ratones se determinaron mediante un análisis de secuencia de ADN del sitio genéticamente modificado (Fig. 1E y Tabla complementaria 3).

La aorta, la vejiga y el útero extirpados se fijaron en paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina. Los tejidos incluidos en parafina se seccionaron en rodajas de 5 μm de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE), Elastica van Gieson (EVG) y tricrómico de Masson (MT). El análisis morfométrico se realizó utilizando ImageJ/Fiji43. La inmunotinción con anticuerpos anti-SM1 y anti-SM2 se realizó como se describió anteriormente14.

Las aortas torácicas se fijaron con glutaraldehído al 2,5% en tampón fosfato 0,1 mol/l (PB, pH 7,4) seguido de fijación en tetróxido de osmio al 1% en PB 0,1 mol/l. Las muestras se incluyeron en resina epoxi, se cortaron en secciones ultrafinas de 70 nm de espesor y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo. Se adquirieron cientos de imágenes digitales de áreas rectangulares compartimentadas que cubren secciones transversales enteras utilizando un detector de electrones retrodispersados en microscopía electrónica de barrido (JSM-7800F, JEOL). Todas las imágenes se unieron en una sola imagen en mosaico y se observaron imágenes en mosaico a gran escala utilizando un visor basado en JavaScript.

Se retiraron aproximadamente 10 mm de los anillos aórticos de los ratones anestesiados y se fijaron con clips de acero inoxidable en un baño de órganos (20 ml) lleno con un tampón de Krebs-Henseleit, que se mantuvo a 37 °C y se aireó con 95% de O2/ 5% de CO2 durante todo el experimento. Todas las tiras de anillos se sometieron a una precarga de 10 mN y se incubaron durante 60 minutos. Las contracciones posteriores a la administración de fenilefrina se determinaron secuencialmente y se corrigieron con el peso del tejido. La tasa de relajación también se obtuvo con la administración posterior de acetilcolina y nitroprusiato de sodio después de alcanzar el pico de la respuesta contráctil a la fenilefrina (10-5 mol/L).

Se implantaron minibombas osmóticas (modelo Alzet 1002; DURECT Corporation) en los ratones a las ocho semanas de edad. Las bombas se llenaron con solución de Ang II (Peptide Institute, Inc.) mediante infusión a una velocidad de 1.000 ng/kg/min. La presión arterial sistólica se midió antes de la implantación y después de dos semanas de tratamiento con Ang II. Todos los ratones que sobrevivieron durante dos semanas fueron sacrificados y se extirparon sus aortas.

La extracción de ARN total y la RT-qPCR se realizaron según procedimientos estándar. Se diseñaron cebadores para los diversos genes y las secuencias se enumeran en la Tabla complementaria 4. Los experimentos se realizaron por triplicado y todos los datos se normalizaron con respecto a la expresión de Gapdh.

Se prepararon lisados de proteínas a partir de la aorta torácica. A continuación, se separaron 5 µg de proteína total para cada muestra en un gel de Bis-Tris al 10% o en un gel de Tris-acetato al 3-8% (Thermo Fisher Scientific) mediante SDS-PAGE, y se electrotransfirieron en membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia en seco iBlot2 ( Invitrogen) e inmunotransferencia con anticuerpos primarios. Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante durante la noche y se visualizaron con un kit de quimioluminiscencia (Bio-Rad Laboratories).

Los modelos se construyeron mediante reemplazo de aminoácidos con la estructura cristalina del fragmento de β-miosina S2 cardíaca humana (ID de PDB, 2FXO) como plantilla para la estructura en espiral utilizando el conjunto de programas del entorno operativo molecular (MOE) (Ver. 2016.08 , Chemical Computing Group Inc., https://www.chemcomp.com).

Los datos se expresan como la media ± SEM. Se utilizó una prueba U de Mann-Whitney para comparar los datos distribuidos entre dos grupos diferentes. Las comparaciones de múltiples grupos que pasaron una prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov se realizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con una prueba post-hoc de Tukey. Un valor de p < 0,05 se consideró significativo y un valor de p < 0,01 se consideró altamente significativo.

Los datos subyacentes a este artículo se compartirán previa solicitud razonable con el autor correspondiente.

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El estudio fue financiado en parte por Investigación sobre subvenciones para investigación científica en áreas prioritarias (B) (subvención n.º 18H02811 a RN) y subvenciones para investigación científica en áreas prioritarias (C) (subvención n.º 18H02811 a RN). 18K08046 a KA) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón.

Estos autores contribuyeron igualmente: Keita Negishi y Kenichi Aizawa.

División de Farmacología Clínica, Departamento de Farmacología, Jichi Medical University, 3311-1 Yakushiji, Shimotsuke, Tochigi, 329-0498, Japón

Keita Negishi, Kenichi Aizawa, Shota Tomida y Yasushi Imai

División de Medicina Cardiovascular, Departamento de Medicina, Universidad Médica de Jichi, Tochigi, Japón

Keita Negishi y Kazuomi Kario

Departamento de Investigación Cardiovascular, Facultad de Medicina de la Universidad Shinshu, Nagano, Japón

Takayuki Shindo y Takayuki Sakurai

Departamento de Ciencias Cardiovasculares, Centro de Investigación Cardiovascular de la Universidad de Leicester, Hospital Glenfield, Leicester, Reino Unido

Toru Suzuki

Centro de integración de sistemas, Hospital Universitario de Gunma, Gunma, Japón

Yuichiro Saito

Departamento de Química Biológica Aplicada, Escuela de Graduados en Ciencias Agrícolas y Biológicas, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Takuya Miyakawa y Masaru Tanokura

Centro RIKEN para la Investigación de la Dinámica de Biosistemas, Kobe, Japón

Yosky Kataoka y Mitsuyo Maeda

Centro de colaboración RIKEN-JEOL, Kobe, Japón

Yosky Kataoka y Mitsuyo Maeda

Departamento de Medicina Cardiovascular, Facultad de Medicina, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

Hiroyuki Morita, Norifumi Takeda e Issei Komuro

Universidad Médica Jichi, 3311-1 Yakushiji, Shimotsuke, Tochigi, 329-0498, Japón

Ryozo Nagai

También puedes buscar este autor en PubMed Google Scholar.

KA y RN concibieron y diseñaron el proyecto; KN, KA, YS, HM, NT, IK, KK, YI y RN analizaron e interpretaron los datos; KN, KA, T.Shindo., T.Sakurai., YK, MM, ST datos adquiridos; TM y MT realizaron análisis computacionales; y KN, KATSuzuki y RN escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Ryozo Nagai o Yasushi Imai.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Vídeo complementario 1.

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Reimpresiones y permisos

Negishi, K., Aizawa, K., Shindo, T. et al. Una deleción única de lisina Myh11 causa disección aórtica al reducir la integridad estructural y la contractilidad de la aorta. Representante científico 12, 8844 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-12418-8

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Recibido: 15 de julio de 2021

Aceptado: 10 de enero de 2022

Publicado: 25 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-12418-8

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