La supresión de CXCL5 recupera la neovascularización y acelera la cicatrización de heridas en la diabetes mellitus

Diabetología cardiovascular volumen 22, Número de artículo: 172 (2023) Citar este artículo

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Se publicó una corrección a este artículo el 1 de agosto de 2023.

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Se observó un nivel más alto del ligando 5 del motivo CXC de quimiocina (CXCL5) en pacientes con diabetes mellitus (DM) tipo 2; sin embargo, no se aclaró su papel en la vasculopatía diabética. Este estudio tuvo como objetivo explorar los impactos y los conocimientos mecanicistas de CXCL5 en la neovasculogénesis y la cicatrización de heridas en la DM.

Se utilizaron in vitro células progenitoras endoteliales (EPC) y células endoteliales aórticas humanas (HAEC). Se utilizaron ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina y ratones Leprdb/JNarl como modelos de DM tipo 1 y tipo 2. Además, se utilizaron ratones knockout para CXCL5 para generar ratones diabéticos. Se realizaron cirugía de isquemia de las extremidades posteriores, ensayos del anillo aórtico, ensayo del tapón de matrigel y ensayo de cicatrización de heridas.

Las concentraciones de CXCL5 aumentaron en plasma y medio de cultivo de EPC de pacientes con DM tipo 2. El anticuerpo neutralizante CXCL5 aumentó el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)/factor 1 derivado de células estromales (SDF-1) y promovió la función celular en EPC de pacientes con DM tipo 2 y EPC tratadas con alto contenido de glucosa de sujetos sin DM, así como HAEC . CXCL5 aumentó directamente la interleucina (IL) -1β/IL-6/factor de necrosis tumoral-α y VEGF/SDF-1 disminuyó mediante la activación de ERK/p65 a través del receptor 2 del motivo CXC de quimiocina (CXCR2). El anticuerpo neutralizante CXCL5 recuperó el flujo sanguíneo después de la isquemia de las extremidades posteriores, aumentó el número de EPC circulantes y mejoró la expresión de VEGF y SDF-1 en el músculo isquémico. La supresión de CXCL5 promovió la neovascularización y la cicatrización de heridas en diferentes modelos animales diabéticos. La observación anterior también podría observarse en ratones diabéticos knockout para CXCL5 inducido por estreptozotocina.

La supresión de CXCL5 podría mejorar la neovascularización y la cicatrización de heridas a través de CXCR2 en la DM. CXCL5 puede considerarse como un objetivo terapéutico potencial para las complicaciones vasculares de la DM.

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad metabólica crónica. Los pacientes sufren de secreción insuficiente de insulina o resistencia a la insulina, lo que provoca hiperglucemia [1,2,3]. La hiperglucemia causa una disminución de la proliferación de células endoteliales y un menor reclutamiento de células progenitoras endoteliales (EPC), lo que resulta en una angiogénesis disfuncional. De hecho, la angiogénesis disfuncional ha estado implicada en las complicaciones vasculares de la DM. La enfermedad arterial periférica (EAP) es una de las complicaciones más graves [4, 5] y la principal causa de muerte en pacientes con DM [6]. Además, los pacientes con DM y EAP tienen problemas de cicatrización de heridas [7]. Para el tratamiento de la oclusión de grandes vasos en la EAP grave, generalmente se realiza la revascularización quirúrgica, pero para la isquemia extensa y/o de vasos pequeños (diámetro de vaso de 2 a 5 mm), la principal opción es el tratamiento con fármacos angiogénicos y la terapia de regeneración [8]. La formación de vasos neocapilares y la respuesta remodelada están implicadas en la recuperación del flujo sanguíneo al tejido isquémico. Por lo tanto, se necesita con urgencia el potencial terapéutico de la estrategia de neovascularización emergente para la vasculopatía diabética.

El ligando 5 del motivo CXC de quimiocina (CXCL5), también conocido como péptido activador de neutrófilos epiteliales, es una quimiocina que está implicada principalmente en la quimiotaxis de las células inflamatorias [9, 10]. CXCL5 promueve la migración de neutrófilos y activa la respuesta inflamatoria a través del receptor 2 del motivo CXC de quimiocina (CXCR2) [11]. El nivel de CXCL5 aumentó en modelos de ratón con DM y en entornos clínicos [12,13,14,15,16]. CXCL5 podría inducir resistencia a la insulina al inhibir la vía de señalización de la insulina en músculos, tejido adiposo y macrófagos. Los niveles elevados de CXCL5 estuvieron acompañados de una función deteriorada de los islotes [17]. La inhibición de CXCL5 por anticuerpos neutralizantes podría mejorar la sensibilidad a la insulina y el aclaramiento de glucosa en ratones obesos resistentes a la insulina [18, 19]. En conjunto, CXCL5 puede estar aumentado en la DM y estar involucrado en el desarrollo y progresión de enfermedades vasculares.

En teoría, CXCL5 podría contribuir a las complicaciones vasculares en la diabetes, aunque aún no se ha establecido el vínculo directo ni el mecanismo detallado. Dada la importancia clínica de la vasculopatía diabética, este estudio tuvo como objetivo investigar los impactos potenciales y los conocimientos mecanicistas de CXCL5 en la vasculopatía diabética. Se utilizaron modelos experimentales en serie in vitro e in vivo para evaluar si la inhibición directa mediante anticuerpos neutralizantes o la deficiencia de CXCL5 mediante eliminación genética podría mejorar la vasculopatía relacionada con la diabetes. Los resultados pueden respaldar el papel potencial de CXCL5 como una nueva diana terapéutica para la vasculopatía diabética.

La muestra de sangre se recogió de las venas periféricas de pacientes con DM tipo 2 y sujetos sin DM. Sólo se inscribieron pacientes con DM tipo 2 estable sin tratamiento con insulina. Se excluyeron los pacientes con otras enfermedades sistémicas importantes, que recibieron una operación importante en los últimos 6 meses o que actualmente estaban bajo tratamiento médico por otras enfermedades. Los datos demográficos y clínicos se obtuvieron en el momento de la inscripción. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes individuales incluidos en el estudio. El estudio en humanos fue aprobado por el comité de investigación del instituto y cumplió con la Declaración de Helsinki. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital General de Veteranos de Taipei (IRB-2018-01-001AC).

Después de extraer la sangre, las células mononucleares totales se separaron con Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, 10771, Darmstadt, Alemania) y se centrifugaron a 500 xg a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células mononucleares se cultivaron en medio basal de células endoteliales (Lonza, CC-3156, Basilea, Suiza), con suplementos que incluían hidrocortisona, factores de crecimiento de fibroblastos humanos, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento similar a la insulina R3-1, ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico humano, sulfato de gentamicina-anfotericina y suero bovino fetal al 20% en placas de 6 pocillos recubiertas de fibronectina. Después de 2 a 4 semanas de cultivo, las EPC adheridas tenían forma de adoquines, y este tipo de forma es el patrón de crecimiento típico en monocapa de las células endoteliales maduras. Se cultivaron células endoteliales aórticas humanas (HAEC; ScienCell, catálogo n.° 6100, Carlsbad, CA, EE. UU.) con medio de células endoteliales que contenía VEGF y penicilina/estreptomicina al 1 % (Sigma-Aldrich, P4333, Darmstadt, Alemania), y se recubrieron placas de cultivo. con fibronectina antes de su uso. Para imitar la hiperglucemia en la DM, administramos 25 mM de glucosa alta (HG) durante 2 días a EPC de sujetos sin DM o HAEC. Algunas células se trataron con anticuerpo monoclonal CXCL5 (1 o 10 μg/ml; R&D Systems, MAB-254, Minneapolis, MN, EE. UU.) o proteína CXCL5 humana recombinante (1 o 10 ng/ml; R&D Systems, 254-XB, Minneapolis , MN, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio de cultivo suplementado con suero fetal bovino (concentración final del 5 % v/v) en una atmósfera de 95 % de aire y 5 % de CO2 a 37 °C.

En otra parte del estudio, se utilizaron los siguientes inhibidores para explorar las vías de señalización: un inhibidor de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) (10 μM; U0126; Cayman Chemical Company, No. 70970, Ann Arbor, MI, EE. UU.) y un antagonista selectivo de CXCR2 (10 o 100 nM; SB332235; Cayman Chemical Company, No. 32869, Ann Arbor, MI, EE. UU.). Los reactivos anteriores se agregaron 1 h antes de la administración de la proteína CXCL5 humana recombinante.

La concentración de CXCL5 se midió utilizando un kit ELISA (R&D Systems, DX000 y MX000, Minneapolis, MN, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para evaluar la capacidad de migración de células basales de las células, las células (1 x 104 células) se sembraron en la cámara superior de una placa Transwell de 24 pocillos con membrana de policarbonato. Luego, las células migraron hacia la cámara inferior que contenía 600 μL de medio de cultivo con FBS a 37 °C en 5% de CO2. Después de 18 h, las células migradas se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con solución de hematoxilina. Las imágenes fueron capturadas por un microscopio de alta potencia (100 ×).

Las células (1 x 104 células) se sembraron en gel ECMatrix (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) en placas de 96 pocillos en 100 μl de medio de cultivo con FBS al 10% durante 16 h a 37 °C en CO2 al 5%. Las imágenes fueron capturadas con un microscopio de alta potencia (40 ×). El número de redes de células formadas se calculó utilizando Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc. Rockville, MD, EE. UU.).

Los lisados ​​​​totales de células o tejidos se extrajeron utilizando tampón de lisis y las proteínas se separaron en geles SDS-PAGE al 8-12% (v/v). Después de la electroforesis (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.), las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Darmstadt, Alemania) y las membranas se incubaron con anti-VEGF (Santa Cruz Biotechnology, sc-152, Dallas, TX, EE. UU.), factor anti-derivado de células estromales (SDF)-1 (Cell Signaling Technology, 3530S, Boston, MA, EE. UU.), anti-interleucina (IL)-1β (Santa Cruz Biotechnology, sc-52012, Dallas, TX, EE. UU.), anti-IL-6 (Santa Cruz Biotechnology, sc-1265, Dallas, TX, EE. UU.), factor de necrosis antitumoral (TNF) -α (Santa Cruz Biotechnology, sc-52746, Dallas, TX, EE. UU. ), anti-p-ERK (Cell Signaling, 9106S, Boston, MA, EE. UU.), anti-ERK (Cell Signaling, 9102S, Boston, MA, EE. UU.), anti-CXCR2 (Santa Cruz Biotechnology, sc-7304, Dallas, TX, EE. UU.), anti-CXCL5 (R&D, MAB254, Minneapolis, MN, EE. UU.), anti-p-p65 (Cell Signaling Technology, #3031S, Danvers, MA, EE. UU.), anti-p65 (BD, 0079008, East Rutherford , Nueva Jersey) y anti-actina (Merck, 3423208, Darmstadt, Alemania) a las 4 horas de la noche. Después de lavar tres veces, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (1:1000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las membranas se visualizaron utilizando el kit ECL.

Las HAEC se incubaron con CXCL5 1 o 10 ng/ml de proteína recombinante (R&D, 254-XB, Minneapolis, MN, EE. UU.) durante 30 minutos. Las células se enfriaron en hielo y los extractos celulares se prepararon con tampón de lisis (Triton X-100 al 1%, EDTA 2,5 mM, Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 5%, PMSF 1 mM, pH 7,4). Los lisados ​​se aclararon mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 30 minutos y se incubaron con anti-CXCR2 (Santa Cruz Biotechnology, sc-7304, Dallas, TX, EE. UU.) unido a perlas de agarosa durante la noche a 4 ° C en un balanceo. Luego se recogieron las perlas mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 3 minutos a 4 °C y se lavaron exhaustivamente en tampón de lisis. Las proteínas se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 12%, se transfirieron a una membrana de PVDF y se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos correspondientes.

Se utilizaron de forma independiente modelos preclínicos etiológicamente distintos. Se adquirieron ratones macho FVB / NCrlBltw de seis semanas de edad de BioLASCO (Taipei, Taiwán). A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 40 mg/kg de estreptozotocina (STZ; Sigma-Aldrich, S0130, Darmstadt, Alemania) durante 5 días. El experimento comenzó cuando el nivel de azúcar en sangre de los ratones era superior a 250 mg/dL. Se adquirieron ratones macho BKS.Cg-m+/+Leprdb/JNarl de seis semanas de edad en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). Todos los ratones se aclimataron durante 2 semanas antes de los experimentos. Para el tratamiento de la cirugía de isquemia de las extremidades posteriores, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal anticuerpo monoclonal CXCL5 (R&D, MAB433, Minneapolis, MN, EE. UU.) o anticuerpo monoclonal IgG (R&D, MAB0061, Minneapolis, MN, EE. UU.) a 10 o 100 μg tres veces por semana durante un mes.

Se diseñaron ratones knockout C57BL/6JNarl-Cxcl5em1 machos de seis semanas de edad y se compraron en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán). Se produjeron ratones knockout CXCL5 (CXCL5KO) con un fondo genético C57BL/6JNarl utilizando el sistema CRISPR/Cas9. En conjunto, se microinyectaron embriones fertilizados de ratones C57BL/6JNarl con sgRNA y Cas9 mRNA. Para análisis fenotípicos en paralelo con compañeros de camada de tipo salvaje (WT) de la misma edad y sexo, se produjeron ratones knockout homocigotos a partir de un cruce heterocigoto. Todos los ratones se genotiparon mediante PCR con cebadores específicos (adelante, 5′-TCTTAAAGGGTTGAGCCATCTCCC-3 'y reverso, 5′-CCCATTATGATCTAAAATCCCCACC-3'). Los ratones se criaron en condiciones específicas libres de patógenos y se mantuvieron en jaulas microaisladoras con ciclos de luz/oscuridad de 12:12 h y libre acceso al agua y a la comida estándar para ratones. A los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal 40 mg/kg de STZ durante 5 días. El experimento comenzó cuando su nivel de azúcar en sangre era superior a 250 mg/dL. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung (IACUC No. 1091104).

La cirugía de isquemia unilateral de las extremidades posteriores se utilizó en nuestra publicación anterior [20]. Para ser específicos, los ratones fueron anestesiados mediante inhalación de isoflurano al 3% y expuestos durante 10 minutos una vez a la semana. Luego se afeitaron los ratones y se limpió el sitio quirúrgico con etanol al 70%. La arteria y la vena femorales se separaron del nervio femoral y se ligaron las porciones proximal y distal de la arteria femoral derecha y la porción distal de la arteria safena derecha. Luego, se diseccionaron y extirparon las arterias y todas las ramas laterales. La piel se cerró con una sutura discontinua. El flujo sanguíneo de isquemia de las extremidades posteriores se analizó mediante imágenes de perfusión con láser Doppler (Moor Instruments Limited, Devon, Reino Unido) en los días 0, 7, 14, 21 y 28 después de la cirugía. La tasa de reperfusión en la extremidad trasera se calculó como una relación del flujo sanguíneo en la extremidad isquémica en comparación con la extremidad no isquémica para cada ratón. Todos los ratones fueron anestesiados con isoflurano inhalado y sacrificados mediante desangrado cardíaco 28 días después de la cirugía isquémica. Se extrajo el músculo gastrocnemio de cada pierna para análisis de inmunohistoquímica o expresión de proteínas.

Las células mononucleares de sangre periférica se suspendieron en solución salina y se incubaron con isotiocianato de fluoresceína anti-antígeno de células madre de ratón (Sca)-1 (Invitrogen, 11-5981-82, Carlsbad, CA, EE. UU.) y ficoeritrina anti-receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de ratón. 2, también conocido como Flk-1 (Invitrogen, 12-5821-82, Carlsbad, CA, EE. UU.) a temperatura ambiente durante 30 min. Se utilizó un citómetro de flujo BD FACScalibur (BD, East Rutherford, Nueva Jersey) y los datos se analizaron con FloJo (Treestar). Los datos se presentan como % controlado, en relación con el grupo de control.

Las EPC se recogieron y se lavaron antes de suspenderlas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para citometría de flujo. Para identificar las características de las EPC, VE-cadherina (Biolegend, 348505, San Diego, CA), CD31 (Biolegend, 303117, San Diego, CA), CD34 (BD, 555821, East Rutherford, Nueva Jersey), KDR (R&D, FAP357 , Minneapolis, MN, EE. UU.), CD133 (MACS, 130-111-756, Alemania), CD3 (Biolegend, 300407, San Diego, CA), CD68 (Biolegend, 333805, San Diego, CA), CD86 (Biolegend, 374203 , San Diego, CA), CD163 (Biolegend, 33605, San Diego, CA) y CD206 (Biolegend, 321123, San Diego, CA). Las células se analizaron con un citómetro de flujo BD FACScalibur (BD, East Rutherford, Nueva Jersey) y los datos se analizaron con FloJo (Treestar). Los datos se presentan como % controlado.

El ensayo del anillo aórtico se utilizó en nuestra publicación anterior [21]. Luego se cortaron los anillos aórticos a 0,5 mm y se incluyeron en una matriz de colágeno de cola de rata tipo 1 de 1 mg/ml (Millipore, 08115, Darmstadt, Alemania) con incubación durante 1 h a 37 °C. Los anillos aórticos se cultivaron utilizando medio basal 2 de crecimiento de células endoteliales (Lonza, Bend, OR, EE. UU.) con suplementos (hidrocortisona, factores de crecimiento de fibroblastos humanos, VEGF, factor de crecimiento similar a la insulina R3-1, ácido ascórbico, factor de crecimiento epidérmico humano , sulfato de gentamicina-anfotericina) que contiene suero bovino fetal al 2,5 % (Gibco, Carlsbad, CA, EE. UU.), penicilina 50 U/mL, estreptomicina 0,5 mg/mL (Sigma-Aldrich, P4333, Darmstadt, Alemania) y 30 ng/mL. VEGF (Peprotech, 100-20, Rocky Hill, CT, EE. UU.) en placas de 24 pocillos durante 7 días. Después del cultivo, los anillos aórticos se incubaron con isotiocianato de fluoresceína anti-lectina B4 (Sigma-Aldrich, L9006, Darmstadt, Alemania) a 4 °C durante la noche. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio fluorescente (100 ×).

El ensayo de neovascularización del tapón de matrigel se utilizó en nuestra publicación anterior [22]. En detalle, los ratones fueron anestesiados mediante inhalación de isoflurano al 3% y expuestos durante 10 minutos en este ensayo. A los ratones se les inyectó por vía subcutánea una matriz de membrana basal con factor de crecimiento reducido (TFG) (Corning® Matrigel, 356231, Glendale, AZ, EE. UU.) que contenía 30 ng/ml de VEGF (Peprotech, 100-20, Rocky Hill, CT, EE. UU.) y 50 U. /mL de heparina (Sigma-Aldrich, H3393, Darmstadt, Alemania). El gel formó un tapón sólido cuando alcanzó la temperatura corporal. Después de 14 días, los tapones se recogieron y homogeneizaron con 500 μl de tampón de lisis celular y se centrifugaron a 6000 xg a 4 °C durante 60 min. Se utilizó un ensayo colorimétrico (Sigma-Aldrich, MAK115, Darmstadt, Alemania) para detectar hemoglobina con un lector de microplacas a una longitud de onda de 400 nm. El tapón se recogió para análisis histológico e inmunohistoquímico.

El ensayo de cicatrización de heridas se utilizó en nuestra publicación anterior [22]. Para ser específicos, los ratones fueron anestesiados mediante inhalación de isoflurano al 3% y expuestos durante 3 minutos en este ensayo. La piel de la espalda se afeitó y se limpió con una solución de jabón antibacteriano y etanol al 70%. Se generaron heridas de escisión circulares de espesor total de 3 mm de diámetro mediante punción de biopsia sin lesión muscular. Las heridas se registraron utilizando una cámara digital (Nikon, Tokio, Japón) a los 0, 1, 3, 5 y 8 días después de su generación.

La muestra de tejido se fijó con paraformaldehído al 4% durante 24 h, se deshidrató en alcoholes graduados y luego se embebió en cera de parafina. Los tejidos se seccionaron en muestras de 5 µm de espesor. Las secciones se secaron durante la noche y se tiñeron con hematoxilina y eosina y tinción tricrómica de Masson para análisis histológico. Los tejidos incluidos en cera de parafina se seccionaron con un espesor de 5 μm y se rehidrataron. La recuperación del antígeno se realizó utilizando tampón citrato de sodio 0,05 M. Luego, los portaobjetos se incubaron a 4 °C durante la noche con el anticuerpo primario para detectar CD31 (Abcam, 124432, Waltham, MA, EE. UU.). La muestra se lavó con solución de PBS y se incubó con un anticuerpo secundario (conejo) durante 2 h a temperatura ambiente. En la tinción tricrómica de Masson, se seccionaron tejidos incluidos en cera de parafina con un espesor de 3 μm, que se tiñeron con solución de trabajo de hematoxilina férrica de Weigert durante 10 minutos. Luego, las secciones se tiñeron con una solución de fucsina de ácido escarlata de Biebrich y una solución de ácido fosfomolíbdico-fospotungstico durante 15 minutos. Finalmente, las secciones se transfirieron a una solución de azul de anilina durante 10 min.

Después de 4 h de ayuno, se extrajo 1 μL de sangre de ratón de la cola. Se utilizó un glucómetro Abbott FreeStyle (Abbot-OPTIUM XCEED) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante original.

Dada la naturaleza no paramétrica de nuestros datos, utilizamos la mediana y el intercuartil para la estadística descriptiva y la prueba U de Mann-Whitney para identificar las diferencias grupales. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

El nivel de concentración de CXCL5 aumentó en plasma de pacientes con DM tipo 2 en comparación con sujetos sin DM (Fig. 1A). La concentración de CXCL5 en el medio de cultivo de EPC de pacientes con DM tipo 2 aumentó en comparación con sujetos sin DM (Fig. 1B). Se mostraron las características clínicas de la población de estudio (archivo adicional 1: Tabla S1). Las EPC utilizadas en este estudio fueron positivas para marcadores de células endoteliales vasculares como VE-cadherina, CD31, CD34, KDR, CD133 y negativas para marcadores de macrófagos como CD3, CD68, CD86, CD163 y CD206 (archivo adicional 1: Fig. .S1). La administración del anticuerpo neutralizante CXCL5 en cantidades de 10 µg/ml reparó la formación de redes y las capacidades de migración de las EPC de pacientes con DM tipo 2 (Fig. 1C, D). El tratamiento del anticuerpo neutralizante CXCL5 a 10 µg/ml mejoró la expresión de proteínas de VEGF y SDF-1 en EPC de pacientes con DM tipo 2 (Fig. 1E). Por lo tanto, estos resultados indicaron que el anticuerpo neutralizante CXCL5 podría aumentar la expresión de las proteínas VEGF y SDF-1 para promover la migración y la capacidad de angiogénesis in vitro de las EPC de pacientes con DM tipo 2.

El tratamiento con anticuerpo neutralizante CXCL5 aumentó la expresión de VEGF/SDF-1 y promovió la angiogénesis en EPC tardías de pacientes con DM tipo 2. Niveles plasmáticos de CXCL5 en pacientes con DM tipo 2 y sujetos sin DM (n = 6; A). EPC niveles medios de CXCL5 en pacientes con DM tipo 2 y sujetos sin DM (n = 6; B). Las capacidades de formación y migración de redes mejoraron después de la administración de mAb CXCL5 en EPC de pacientes con DM tipo 2 (n = 3; C, D). Transferencia Western y análisis estadísticos de VEGF y SDF-1 en EPC de pacientes con DM tipo 2 (n = 3; E). Ligando 5 del motivo CXC de quimiocina CXCL5, diabetes mellitus DM, célula progenitora endotelial EPC, anticuerpo monoclonal mAb, factor 1 derivado de células estromales SDF-1, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF. N representa células cultivadas de n individuos diferentes, y las células cultivadas de cada individuo se experimentaron durante tres experimentos independientes. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar diferencias estadísticamente significativas. *p < 0,05, **p < 0,01

El tratamiento con anticuerpo neutralizante CXCL5 a 10 µg/ml reparó la formación de redes y las capacidades de migración de las EPC estimuladas por HG de sujetos sin DM (Fig. 2A, B). La administración del anticuerpo neutralizante CXCL5 en dosis de 10 µg/ml aumentó la expresión de proteínas de VEGF y SDF-1 en EPC estimuladas con HG de sujetos sin DM (Fig. 2C). Por otro lado, los tratamientos con anticuerpo neutralizante CXCL5 a 10 µg/mL repararon la capacidad de angiogénesis y migración in vitro en condiciones de HG (Fig. 2D, E). Mientras tanto, la administración del anticuerpo neutralizante CXCL5 a 10 µg/ml aumentó la expresión de proteínas de VEGF y SDF-1 en HAEC estimuladas con HG en comparación con el grupo HG (Fig. 2F). Según estos resultados, el tratamiento con el anticuerpo neutralizante CXCL5 aumentó la expresión de las proteínas VEGF y SDF-1 para reparar la migración deteriorada y la capacidad de angiogénesis in vitro de las EPC y HAEC bajo las estimulaciones con HG.

El tratamiento con el anticuerpo neutralizante CXCL5 aumentó la expresión de VEGF/SDF-1 y promovió la angiogénesis en EPC tardías de sujetos sin DM y HAEC en condiciones de HG. Las capacidades de formación y migración de redes mejoraron después de la administración de mAb CXCL5 en EPC de sujetos sin DM (n = 3; A, B). Transferencia Western y análisis estadísticos de VEGF y SDF-1 en EPC de sujetos sin DM (n = 3; C). Las capacidades de formación y migración de redes mejoraron después de la administración de mAb CXCL5 en HAEC (n = 3; D, E). Transferencia Western y análisis estadísticos de VEGF y SDF-1 en HAEC (n = 3; F). Ligando de quimiocina 5 con motivo CXCL5 CXC, célula progenitora endotelial EPC, glucosa alta en HG, célula endotelial aórtica humana HAEC, mAb, anticuerpo monoclonal, factor 1 derivado de células estromales SDF-1, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF. N representa el número de experimentos independientes en diferentes días y en diferentes ejecuciones experimentales. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar diferencias estadísticamente significativas. *p < 0,05, **p < 0,01

La administración de CXCL5 perjudicó la formación de redes y las capacidades de migración en HAEC (Fig. 3A, B). La fosforilación de ERK y p65 aumentó con la administración de CXCL5 en HAEC (Fig. 3C). Además, la proteína inflamatoria posterior, incluidas IL-1β, IL-6 y TNF-α, se activó mediante tratamientos con CXCL5 (Fig. 3D). Por otro lado, la expresión de proteínas angiogénicas como VEGF y SDF-1 se redujo con los tratamientos con CXCL5 (Fig. 3E). La fosforilación inducida por CXCL5 de p65 y sus proteínas inflamatorias posteriores, incluidas IL-1β, IL-6 y TNF-α, disminuyeron mediante la administración de U0126, un inhibidor de ERK, durante 30 min y 4 h, respectivamente (archivo adicional 1: Fig. .S2A). Después de la administración de U0126 durante 2 días, la expresión disminuida de SDF-1 y VEGF por CXCL5 se revirtió (archivo adicional 1: Fig. S2B).

CXCL5 alteró la función endotelial vascular a través de la vía de señalización ERK/p65 en HAEC. La capacidad de formación de redes y migración se vio afectada después de la administración de CXCL5 durante 2 días (n = 3; A, B). Transferencia Western y análisis estadísticos de p-ERK, p-p65, IL-1β, IL-6 y TNF-α después de la administración de CXCL5 durante 2 días (n = 3; C, D). Transferencia Western y análisis estadísticos de VEGF y SDF-1 después de la administración de CXCL5 durante 2 días (n = 3; E). Transferencia Western de CXCR2 y CXCL5 después de la inmunoprecipitación anti-IgG de cabra y CXCR2 (n = 3; F). Ligando 5 del motivo CXC de la quimiocina CXCL5, receptor 2 del motivo CXC de la quimiocina CXCR2, quinasa regulada por señal extracelular ERK, célula endotelial aórtica humana HAEC, interleucina IL, factor 1 derivado de células estromales SDF-1, factor de necrosis tumoral α TNF-α, VEGF factor de crecimiento vascular endotelial. N representa el número de experimentos independientes en diferentes días y en diferentes ejecuciones experimentales. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar diferencias estadísticamente significativas. *p < 0,05, **p < 0,01

El análisis de inmunoprecipitación mostró que CXCL5 podría interactuar con CXCR2 (Fig. 3F). El p-ERK, IL-1β, IL-6 y TNF-α inducidos por CXCL5 disminuyeron mediante la administración de SB332235, un antagonista de CXCR2, durante 4 h (archivo adicional 1: Fig. S2C). Además, la disminución de la expresión de VEGF y SDF-1 por los tratamientos CXCL5 se revirtió después de 2 días de administración de SB332235 (archivo adicional 1: Fig. S2D). Estos resultados sugirieron que CXCL5 podría alterar la función celular y ejercer efectos proinflamatorios y antiangiogénicos mediante la activación de ERK/p65 a través de CXCR2.

Los ratones diabéticos tenían un peso corporal más bajo y un nivel de glucosa en sangre significativamente mayor. No hubo diferencias significativas en el peso corporal y el azúcar en sangre entre los ratones tratados con mAb CXCL5 y los diabéticos no tratados (archivo adicional 1: Fig. S3A, B). Los niveles séricos de CXCL5 aumentaron en ratones diabéticos inducidos por STZ y se redujeron en los ratones tratados con CXCL5 mAb (Fig. 4A). El flujo sanguíneo en la extremidad posterior isquémica se redujo igualmente después de la cirugía de isquemia de la extremidad posterior en cada grupo de ratones. El flujo sanguíneo se reparó mediante el tratamiento con anticuerpo neutralizante CXCL5 a 100 μg en comparación con el grupo DM (Fig. 4B). Después de la cirugía de isquemia de las extremidades posteriores, el número de EPC en circulación aumentó mediante el tratamiento con el anticuerpo neutralizante CXCL5 en comparación con los grupos de tratamiento con DM y DM con anticuerpos IgG (Fig. 4C). Además, el músculo gastrocnemio isquémico mostró una mayor densidad capilar en el grupo tratado con 100 μg de anticuerpo neutralizante CXCL5 (Fig. 4D). La expresión de proteínas tanto de VEGF como de SDF-1 en el músculo gastrocnemio isquémico aumentó con 100 μg de anticuerpo neutralizante CXCL5 después de 4 semanas de tratamiento en comparación con los grupos de tratamiento con DM y DM con anticuerpos IgG (Fig. 4E).

El anticuerpo neutralizante CXCL5 reparó la neovascularización y la cicatrización de heridas en ratones DM tipo 1. Los niveles séricos de CXCL5 en los ratones diabéticos fueron más altos que los del control sin DM. El tratamiento con CXCL5 mAb redujo los niveles de CXCL5 (n = 6; A). Evaluación representativa de las extremidades posteriores isquémicas (derecha) y no isquémicas (izquierda) antes, inmediatamente después de 2 semanas y 4 semanas después de la cirugía de isquemia de las extremidades posteriores en ratones diabéticos tipo 1 inducidos por STZ (n = 6; B). El número de EPC circulantes se determinó mediante citometría de flujo en ratones con diabetes tipo 1 inducida por STZ. El tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5 aumentó el número de EPC circulantes después de la cirugía de isquemia en comparación con la DM (n = 6; C). La inmunotinción anti-CD31 mostró que el tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5 aumentó significativamente el número de capilares. Barra de escala, 50 µm (n = 6; D) Transferencia Western y análisis estadísticos de VEGF y SDF-1 en la pierna con isquemia (n = 3; E). La angiogénesis en cultivos de anillo aórtico de ratones CXCL5 mAb 100 μg aumentó significativamente el número de vasos que brotaron en comparación con los ratones DM. Barra de escala, 50 µm (n = 3; F). Imágenes representativas de tapones de matrigel y análisis del contenido de hemoglobina (n = 6; G). Imágenes representativas de tapones de matrigel con inmunotinción de CD31. Las áreas positivas para CD31 mejoraron en los ratones de tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5. Barra de escala, 50 µm (H). El tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5 mejoró la capacidad de reparación de heridas en ratones con diabetes tipo 1 inducida por STZ. Se midieron áreas representativas de la herida y las tasas de cierre de biopsias con sacabocados de 3 mm (n = 6; I). Imágenes representativas del área de la herida con inmunotinción de CD31. Las áreas positivas para CD31 mejoraron en los ratones tratados con 100 μg de mAb CXCL5. Barra de escala, 50 µm (J). Imágenes representativas de la piel con tinción tricrómica de Masson. Las deposiciones de colágeno mejoraron en los ratones de tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5. Barra de escala, 50 y 500 µm (K). Ligando 5 del motivo CXC de quimiocina CXCL5, diabetes mellitus DM, célula progenitora endotelial EPC, anticuerpo monoclonal mAb, estreptozotocina STZ, factor 1 derivado de células estromales SDF-1, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar diferencias estadísticamente significativas. *p < 0,05, **p < 0,01 en comparación con el control sin DM. #p < 0,05, ##p < 0,01 en comparación con el grupo de DM no tratado

Además, se utilizaron modelos de estudio in vivo más complejos, como el ensayo del anillo de germinación aórtica y el ensayo del tapón matrigel, para confirmar los impactos angiogénicos de la inhibición de CXCL5 en la DM tipo 1. El ensayo del anillo aórtico tenía propiedades vasculares originales. Sin embargo, el brote aórtico en los anillos aórticos de los ratones tratados con DM y anticuerpos IgG se vio claramente afectado. La administración del anticuerpo neutralizante CXCL5 promovió el brote de vasos en comparación con los grupos de tratamiento con anticuerpos DM e IgG (Fig. 4F). En el ensayo de tapón de matrigel, la administración del anticuerpo neutralizante CXCL5 a 100 μg mejoró el contenido de hemoglobina y las densidades capilares en comparación con el grupo de DM no tratado (Fig. 4G, H). También se mostraron imágenes representativas de tapones de matrigel con tinción H&E (archivo adicional 1: Fig. S3C).

Después de una biopsia, se demostró la cicatrización de la herida cutánea en la piel dorsal. El cierre de la herida se completó esencialmente en el grupo de control sin DM después de 5 días. El tratamiento del anticuerpo neutralizante CXCL5 a 100 μg aumentó el porcentaje de cierre de la herida en comparación con los grupos de tratamiento con DM y DM con anticuerpo IgG después de 3 días (Fig. 4I). También se mostraron imágenes representativas del área de la herida con tinción H&E (archivo adicional 1: Fig. S3D). Además, la administración del anticuerpo neutralizante CXCL5 aumentó el número de vasos CD31 positivos y la deposición acumulada de colágeno en el área de la herida en comparación con el grupo DM y el grupo de tratamiento con anticuerpos IgG (Fig. 4J, K). En conjunto, hay pruebas sólidas que respaldan que la inhibición de CXCL5 podría mejorar la neovascularización en ratones con DM tipo 1.

Los ratones diabéticos tenían mayor peso corporal y niveles de glucosa en sangre. No hubo diferencias significativas en el peso corporal y el azúcar en sangre entre los ratones tratados con mAb CXCL5 y los diabéticos no tratados (archivo adicional 1: Fig. S4A, B). Los niveles séricos de CXCL5 aumentaron en ratones diabéticos y se redujeron en los ratones tratados con CXCL5 mAb (Fig. 5A). Después de la cirugía de isquemia de las extremidades posteriores, el flujo sanguíneo se reparó mediante el tratamiento con anticuerpo neutralizante CXCL5 en comparación con el grupo de DM (Fig. 5B). La cantidad de EPC en circulación en ratones sin DM aumentó significativamente después de la cirugía. Sin embargo, el número de EPC no aumentó después de la cirugía en los grupos de anticuerpos DM e IgG, pero se revirtió en el grupo tratado con anticuerpos neutralizantes CXCL5 (Fig. 5C). Además, la densidad capilar aumentó en el grupo tratado con anticuerpo neutralizante CXCL5 (Fig. 5D). La expresión de proteínas tanto de VEGF como de SDF-1 en el músculo gastrocnemio isquémico aumentó con 100 μg de anticuerpo neutralizante CXCL5 después de 4 semanas de tratamiento en comparación con los grupos de tratamiento con DM y DM con anticuerpos IgG (Fig. 5E). Además, el tratamiento con anticuerpo neutralizante CXCL5 podría mejorar el contenido de hemoglobina y la formación de vasos en el ensayo de tapón de matrigel (Fig. 5F, G). También se mostraron imágenes representativas de tapones de matrigel con tinción H&E (archivo adicional 1: Fig. S4C).

La neovascularización y la cicatrización de heridas mejoraron mediante la neutralización de los anticuerpos CXCL5 en ratones DM tipo 2. El tratamiento con CXCL5 mAb redujo los niveles de CXCL5 en ratones diabéticos (n = 6; A). Evaluación representativa de las extremidades posteriores isquémicas (derecha) y no isquémicas (izquierda) antes, inmediatamente después de 2 semanas y 4 semanas después de la cirugía de isquemia de las extremidades posteriores en ratones db/db (n = 6; B). El número de EPC circulantes se determinó mediante citometría de flujo en ratones db/db. El tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5 aumentó el número de EPC circulantes después de la cirugía de isquemia en comparación con la DM (n = 6; C). La inmunotinción anti-CD31 mostró que el tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5 aumentó significativamente el número de capilares. Barra de escala, 50 µm (n = 6; D). Transferencia Western y análisis estadísticos de VEGF y SDF-1 en la pierna isquemia (n = 3; E). Imágenes representativas de tapones de matrigel y análisis del contenido de hemoglobina (n = 6; F). Imágenes representativas de tapones de matrigel con inmunotinción de CD31. Las áreas positivas para CD31 mejoraron en los ratones de tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5. Barra de escala, 50 µm (G). El tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5 mejoró la capacidad de reparación de heridas en ratones db/db. Se midieron áreas representativas de la herida y las tasas de cierre de biopsias con sacabocados de 3 mm (n = 6; H). Imágenes representativas del área de la herida con inmunotinción de CD31. Las áreas positivas para CD31 mejoraron en los ratones de tratamiento con 100 μg de mAb CXCL5. Barra de escala, 50 µm (I). Las concentraciones séricas de VEGF y SDF-1 fueron mayores en los ratones de tratamiento con mAb CXCL5 de 100 μg (n = 6; J, K). Ligando 5 del motivo CXC de quimiocina CXCL5, diabetes mellitus DM, célula progenitora endotelial EPC, anticuerpo monoclonal mAb, factor 1 derivado de células estromales SDF-1, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar diferencias estadísticamente significativas. *p < 0,05, **p < 0,01 en comparación con el control sin DM. #p < 0,05, ##p < 0,01 en comparación con el grupo de DM no tratado

En el ensayo de cicatrización de heridas, el tratamiento con el anticuerpo neutralizante CXCL5 promovió el cierre de la herida en comparación con los grupos de tratamiento con DM y DM con anticuerpos IgG (Fig. 5H). También se mostraron imágenes representativas del área de la herida con tinción H&E (archivo adicional 1: Fig. S4D). El tratamiento con anticuerpo neutralizante CXCL5 aumentó el número de vasos en el área de la herida (Fig. 5I). La inhibición de CXCL5 mejoró el nivel de VEGF y SDF-1 en suero (Fig. 5J, K). En conjunto, estas observaciones sugirieron que la inhibición de CXCL5 podría mejorar la neovascularización en ratones con DM tipo 2.

Los ratones diabéticos tenían un peso corporal más bajo y un nivel de glucosa en sangre significativamente mayor. No hubo diferencias significativas en el peso corporal y la glucosa en sangre entre los ratones diabéticos CXCL5KO y los diabéticos WT (archivo adicional 1: Fig. S5A, B). Los ratones knockout para CXCL5 rara vez tenían CXCL5 circulante (Fig. 6A). Para verificar el papel de CXCL5 en la angiogénesis diabética, se utilizó STZ para inducir DM tipo 1 en ratones CXCL5KO. Cuatro semanas después de la cirugía de isquemia de las extremidades posteriores, el grupo STZ tuvo una mala recuperación del flujo sanguíneo. Es importante destacar que la recuperación del flujo sanguíneo mejoró en el grupo CXCL5KO+STZ que en el grupo WT+STZ (Fig. 6B). Después de la cirugía, la cantidad de EPC en circulación no aumentó en el grupo WT+STZ, pero sí aumentó en el grupo CXCL5+STZ (Fig. 6C). El grupo CXCL5KO+STZ mostró una mayor densidad capilar en el músculo gastrocnemio isquémico en comparación con el grupo WT+STZ (Fig. 6D). La expresión de proteínas tanto de VEGF como de SDF-1 en el músculo gastrocnemio isquémico aumentó en el grupo CXCL5KO+STZ después de 4 semanas de tratamiento en comparación con los grupos WT+STZ (Fig. 6E). En el ensayo de tapón de matrigel, el grupo CXCL5KO+STZ también mostró un mayor contenido de hemoglobina y formación de vasos en los tapones de matrigel en comparación con los grupos WT+STZ (Fig. 6F, G). También se mostraron imágenes representativas de tapones de matrigel con tinción H&E (archivo adicional 1: Fig. S5C).

La neovascularización y la cicatrización de heridas mejoraron en ratones diabéticos CXCL5KO inducidos por STZ. Los ratones knockout para CXCL5 rara vez tenían CXCL5 circulante (n = 6; A). Evaluación representativa de las extremidades posteriores isquémicas (derecha) y no isquémicas (izquierda) antes, inmediatamente después de 2 semanas y 4 semanas después de la cirugía de isquemia de las extremidades posteriores en ratones diabéticos tipo 1 inducidos por STZ (n = 6; B). El número de EPC circulantes se determinó mediante citometría de flujo en ratones con diabetes tipo 1 inducida por STZ. La eliminación de la expresión de CXCL5 aumentó el número de EPC circulantes después de la cirugía de isquemia en comparación con la DM (n = 6; C). La inmunotinción anti-CD31 mostró que la inhibición de la expresión de CXCL5 aumentaba significativamente el número de capilares. Barra de escala, 50 µm (n = 6; D). Transferencia Western y análisis estadísticos de VEGF y SDF-1 en la pierna isquemia (n = 3; E). Tapón de matrigel representativo y análisis del contenido de hemoglobina (n = 6; F). Imágenes representativas de tapones de matrigel con inmunotinción de CD31. Las áreas positivas para CD31 mejoraron en los ratones diabéticos knockout para CXCL5. Barra de escala, 50 µm (G). La inhibición de CXCL5 mediante knockout mejoró la capacidad de reparación de heridas en ratones con diabetes tipo 1 inducida por STZ. Se midieron áreas representativas de la herida y las tasas de cierre de biopsias con sacabocados de 3 mm (n = 6; H). Imágenes representativas del área de la herida con inmunotinción de CD31. Las áreas positivas para CD31 mejoraron en los ratones knockout para CXCL5. Barra de escala, 50 µm (I). CXCL5, ligando 5 del motivo CXC de quimiocina; CXCL5KO, ratones knockout para CXCL5; CXCL5KO+STZ, ratones diabéticos knockout para CXCL5. Diabetes mellitus DM, células progenitoras endoteliales EPC, estreptozotocina STZ, ratones WT de tipo salvaje, ratones diabéticos de tipo salvaje WT+STZ. Se utilizó la prueba U de Mann-Whitney para determinar diferencias estadísticamente significativas. *p < 0,05, **p < 0,01 en comparación con el grupo WT. #p < 0,05, ##p < 0,01 en comparación con el grupo WT+STZ

En el ensayo de cicatrización de heridas, el grupo CXCL5KO+STZ ejerció un mayor porcentaje de cierre de heridas en comparación con el grupo WT+STZ (Fig. 6H). También se mostraron imágenes representativas del área de la herida con tinción H&E (archivo adicional 1: Fig. S5D). Además, el grupo CXCL5KO+STZ tenía un mayor número de vasos en el área de la herida (Fig. 6I). En resumen, estos hallazgos indicaron que la deficiencia de CXCL5 podría mejorar la angiogénesis y la neovascularización en la DM.

Hubo una serie de hallazgos interesantes y potencialmente importantes en esta investigación. En primer lugar, las EPC de pacientes con DM tipo 2 liberaron niveles más altos de CXCL5 que las de sujetos sin DM. La inhibición de CXCL5 mediante anticuerpos neutralizantes mejoró la función de EPC en pacientes con DM tipo 2 con expresión mejorada de VEGF y SDF-1, y los resultados fueron los mismos en las HAEC y EPC estimuladas con HG de sujetos sin DM. Además, CXCL5 podría inducir directamente daño a las células endoteliales y ejercer efectos proinflamatorios y antiangiogénicos mediante la regulación positiva de ERK/p65 a través de CXCR2. En segundo lugar, la supresión sistémica de CXCL5 mejoró la recuperación del flujo sanguíneo después de la cirugía de isquemia de las extremidades posteriores, aumentó la cantidad de EPC en circulación y aumentó las expresiones de VEGF y SDF-1 en el músculo gastrocnemio isquémico en ratones DM. En tercer lugar, la supresión de CXCL5 no solo aumentó el contenido de hemoglobina y el número de vasos en el ensayo del tapón de matrigel, sino que también mejoró el número de vasos aórticos en el ensayo del anillo aórtico en ratones DM. En cuarto lugar, la supresión de CXCL5 mejoró el área de cierre de la herida y la acumulación de colágeno en el área de la herida en ratones DM. Es importante destacar que se utilizaron ratones CXCL5KO para generar ratones diabéticos para probar aún más nuestro concepto. De acuerdo con las observaciones anteriores, en comparación con los ratones diabéticos comunes, los ratones diabéticos CXCL5KO habían mejorado la angiogénesis y la neovascularización in vivo. En conjunto, nuestros hallazgos respaldan la idea de que CXCL5 puede desempeñar un papel crítico y mecanicista en la vasculopatía diabética (Fig. 7).

Estos resultados fueron consistentes con los de estudios previos, que revelaron niveles significativamente mayores de CXCL5 en un modelo de ratón con DM tipo 2 y en pacientes con DM tipo 2 [15, 17, 18, 23, 24]. Se pueden desarrollar macro y microvasculopatía con la progresión de la hiperglucemia en entornos clínicos [25]. Las EPC se han asociado bien con la función vascular y la regeneración de tejidos. Tras la isquemia tisular, las CPE pueden movilizarse desde la médula ósea para la reparación vascular y la neovasculogénesis [26]. En pacientes con DM tipo 2, el número y la función de las CPE se ven afectados con la presencia de complicaciones vasculares [27]. Por otro lado, la neovascularización es impulsada por VEGF, que es necesario para la proliferación endotelial, la formación de redes y la migración. SDF-1 recluta EPC de la médula ósea y se une a CXCR4 para promover la angiogénesis [28]. Sin embargo, las expresiones de VEGF y SDF-1 disminuyen en músculos isquémicos y EPC de pacientes con DM [20]. En este estudio, demostramos además que el tratamiento con el anticuerpo neutralizante CXCL5 mejoró la función celular en las EPC de pacientes con DM tipo 2 y en las EPC estimuladas por HG de sujetos sin DM, así como en las HAEC con expresiones de VEGF y SDF-1 reguladas al alza in vitro. Mientras tanto, la inhibición de CXCL5 reparó la angiogénesis del tejido isquémico con VEGF y SDF-1 regulados positivamente en ambos modelos de ratón de DM tipo 1 y tipo 2 in vivo.

Si bien los pacientes diabéticos pueden desarrollar EAP, los pacientes diabéticos con EAP podrían tener una cicatrización de heridas aún mayor. Dado que la angiogénesis es esencial para la cicatrización de heridas y la integridad del tejido, mejorar la cicatrización de heridas es uno de los indicadores in vivo de neovascularización. Un estudio in vivo anterior demostró que los ratones diabéticos tenían heridas mal cicatrizadas con expresiones elevadas de CXCL5 [29]. Por otro lado, se observó que la disminución del nivel de CXCL5 en el exudado podría asociarse de forma independiente con el retraso en la cicatrización de heridas en pacientes con pie diabético [30]. Sin embargo, no se sabía si la reducción del CXCL5 sérico podría promover el desarrollo de úlceras del pie diabético y retrasar la cicatrización de las heridas. Si bien el papel mecanicista de CXCL5 en la curación de las úlceras del pie diabético parece controvertido, se requirió una investigación sistémica adicional [30]. En nuestro estudio, la inhibición sistémica directa de CXCL5 mejoró la cicatrización de la herida con un aumento del área de cierre de la herida, así como la acumulación de colágeno en el área de la herida en diferentes modelos de ratones diabéticos. Los hallazgos anteriores también se confirmaron en ratones diabéticos knockout para CXCL5. En consecuencia, de acuerdo con nuestros hallazgos in vitro sobre EPC de pacientes con diabetes tipo 2, nuestros hallazgos in vivo sugirieron que CXCL5 no era solo un indicador, que podría perjudicar en lugar de promover la angiogénesis, así como la cicatrización de heridas en animales diabéticos. Dado el papel potencial de CXCL5 en la vasculopatía diabética, está indicado realizar estudios clínicos futuros para dilucidar si la inhibición directa del nivel sistémico de CXCL5 puede prevenir el desarrollo de úlceras del pie diabético y mejorar la cicatrización de heridas en pacientes diabéticos tipo 1 y 2.

Hay algunas cuestiones críticas que pueden aclararse aún más. En primer lugar, las citocinas y quimiocinas proinflamatorias pueden participar en el papel patológico de la diabetes. La inflamación puede provocar una neovascularización alterada y provocar células endoteliales y CPE disfuncionales. Anteriormente hemos demostrado que una proteína inflamatoria de quimiocinas-macrófagos (MIP) -1β proinflamatoria está asociada con la neovascularización diabética. MIP-1β redujo la expresión de CXCR4 y provocó EPC disfuncionales, lo que afectó la angiogénesis [20]. Por otro lado, se demostró que CXCL5 activa p65 y el promotor de interleucina (IL) -1β en células endoteliales de origen cardíaco de rata. Además, los neutrófilos activados por CXCL5 amplificaron la respuesta inflamatoria, lo que promovió la apoptosis de las células endoteliales [31]. Según nuestros resultados, se reveló por primera vez que la inhibición directa de CXCL5 mejoraba la función de las células endoteliales y aumentaba la expresión de proteínas proangiogénicas in vivo e in vitro. Si bien tanto MIP-1β como CXCL5 y probablemente otras quimiocinas pueden alterar la angiogénesis en la diabetes, los efectos antiinflamatorios específicos in vivo a través de la supresión de CXCL5 pueden dilucidarse aún más en el futuro. En segundo lugar, un estudio previo indicó que la inhibición de CXCL5 mediante anticuerpos neutralizantes podría mejorar la sensibilidad a la insulina y el aclaramiento de glucosa en ratones obesos resistentes a la insulina [18, 19]. En el estudio actual, los niveles de glucosa en ayunas no cambiaron significativamente por la inhibición directa o la deficiencia de CXCL5 en diferentes modelos animales diabéticos. Los efectos de la inhibición de CXCL5 sobre la glucosa en sangre en ayunas fueron diferentes entre los estudios actuales y anteriores, lo que podría estar relacionado con diferentes dosis y duración del tratamiento con anticuerpos, así como con diferentes edades y diferentes modelos de los animales experimentales (db/db tipo 2). ratones diabéticos y ratones diabéticos tipo 1 inducidos por STZ). En el actual estudio in vivo, no se comprobaron el tejido de los islotes pancreáticos, los niveles de insulina ni la prueba de tolerancia a la glucosa. No se sabe, aunque es menos probable, si el cambio en el nivel de insulina y la resistencia a la insulina pueden afectar los efectos de la inhibición de CXCL5 sobre la angiogénesis en los diferentes modelos animales. Sin embargo, los hallazgos de nuestro estudio in vitro indicaron los efectos beneficiosos de la inhibición directa de CXCL5 en las EPC de pacientes diabéticos tipo 2 y en las EPC tratadas con HG de sujetos sin DM. Dado el papel importante de las EPC y las células endoteliales en la angiogénesis, nuestros hallazgos respaldan la contribución directa de la inhibición de CXCL5 para mejorar la angiogénesis y la cicatrización de heridas en la DM in vivo y estos efectos beneficiosos podrían deberse a sus capacidades angiogénicas y antiinflamatorias. En tercer lugar, nuestro estudio anterior demostró que la inhibición de MIP-1β aumentaba las EPC circulantes al promover su capacidad de localización desde la médula ósea hasta las áreas isquémicas [20]. Aquí, observamos que la inhibición de CXCL5 aumentó el número de EPC circulantes, esto podría deberse a la mejora de la capacidad de localización. Sin embargo, deben abordarse más a fondo otras posibilidades, como una mayor diferenciación y proliferación o una mayor supervivencia.

Resumen de los efectos beneficiosos de la supresión de CXCL5 en la vasculopatía diabética. Ligando 5 del motivo CXC de la quimiocina CXCL5, receptor 2 del motivo CXC de la quimiocina CXCR2, célula progenitora endotelial EPC, quinasa regulada por señal extracelular ERK, diabetes mellitus DM, interleucina IL, factor 1 derivado de células estromales SDF-1, factor de necrosis tumoral TNF-α. α, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF

En conclusión, el CXCL5 plasmático aumentó en pacientes diabéticos tipo 2. La supresión directa de CXCL5 mejoró la función tanto de las EPC como de las HAEC en DM. CXCL5 podría regular positivamente IL-1β/IL-6/TNF-α y regular negativamente VEGF/SDF-1 mediante la activación de ERK/p65 a través de CXCR2. Además, la supresión de CXCL5 aumentó el número de EPC en circulación, mejoró la recuperación del flujo sanguíneo de la pierna isquémica, elevó el contenido de hemoglobina de matrigel y el número de vasos, aumentó la neovascularización del anillo aórtico y aumentó el cierre de heridas en diferentes modelos animales diabéticos. También se pudieron observar hallazgos similares en ratones diabéticos knockout para CXCL5. En conjunto, CXCL5 podría contribuir al deterioro vascular en la DM tanto clínica como experimental. Es posible que esté justificado validar una nueva estrategia terapéutica dirigida a CXCL5 como tratamiento potencial para las complicaciones vasculares de la diabetes en el futuro.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

Se ha publicado una corrección a este artículo: https://doi.org/10.1186/s12933-023-01929-x

Ligando 5 del motivo CXC de quimiocina

Nocaut CXCL5

Receptor 2 del motivo CXC de quimiocina

Diabetes mellitus

Células progenitoras endoteliales

Quinasa regulada por señales extracelulares

Células endoteliales aórticas humanas

glucosa alta

interleucina

Enfermedad de las arterias periféricas

Factor 1 derivado de células estromales

estreptozotocina

Factor de necrosis tumoral

Factor de crecimiento vascular endotelial

Tipo salvaje

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Este trabajo cuenta con el apoyo particular del “Plan de construcción y desarrollo de la Fundación Yin Yen-Liang” de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung.

Este trabajo fue parcialmente financiado por subvenciones de investigación MOST 110-2314-B-A49A-552-MY3 (a TT Chang) y MOST 107-2314-B-010-060-MY3 (a JW Chen) del Ministerio de Ciencia y Tecnología. Taipei, Taiwán, República de China y V110C-065 del Hospital General de Veteranos de Taipei (a JW Chen), Taipei, Taiwán, República de China.

Departamento e Instituto de Farmacología, Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung, Taipei, Taiwán

Ching Chen, Jaw-Wen Chen y Ting-Ting Chang

Facultad de Medicina, Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung, Taipei, Taiwán

Ching Chen, Liang-Yu Lin, Jaw-Wen Chen y Ting-Ting Chang

División de Endocrinología y Metabolismo, Departamento de Medicina, Hospital General de Veteranos de Taipei, Taipei, Taiwán

Liang Yu Lin

Centro de servicios y atención médica, Hospital General de Veteranos de Taipei, Taipei, Taiwán

Jaw-Wen Chen

División de Cardiología, Departamento de Medicina, Hospital Universitario Médico de Taipei, Taipei, Taiwán

Jaw-Wen Chen

Centro de Investigación Cardiovascular, Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung, Taipei, Taiwán

Jaw-Wen Chen

Centro de Investigación Cardiovascular, Universidad Médica de Taipei, Taipei, Taiwán

Jaw-Wen Chen

Doctorado en Industria Biomédica. Programa, Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung, Taipei, Taiwán

Ting Ting Chang

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CC: investigación, redacción—borrador original. L-YL: análisis formal, recurso. J-WC: conceptualización, redacción, revisión y edición, adquisición de financiación. T-TC: conceptualización, investigación, redacción: revisión y edición, supervisión, adquisición de financiación. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Ting-Ting Chang.

El estudio en humanos fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital General de Veteranos de Taipei (IRB-2018-01-001AC). Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes individuales incluidos en el estudio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Nacional Yang Ming Chiao Tung (IACUC No. 1091104).

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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Se revisó la versión original en línea de este artículo: se corrigieron los errores en la Figura 6H.

Características clínicas de la población de estudio. Figura S1. Morfología y caracterización de EPC humanas de sangre periférica. Figura S2. CXCL5 ejerció efectos proinflamatorios y antiangiogénicos mediante la activación de ERK/p65 a través de CXCR2. Figura S3. Los efectos del anticuerpo neutralizante CXCL5 sobre el peso corporal, la glucosa en sangre y la tinción H&E de secciones de tapones de matrigel y áreas de heridas en ratones DM tipo 1. Figura S4. Los efectos del anticuerpo neutralizante CXCL5 sobre el peso corporal, la glucosa en sangre y la tinción H&E de secciones de tapones de matrigel y áreas de heridas en ratones DM tipo 2. Figura S5. El peso corporal, la glucosa en sangre y la tinción con H&E de secciones de tapones de matrigel y áreas de heridas en ratones diabéticos CXCL5KO inducidos por STZ. Figura S6. Complete los geles de transferencia Western en este estudio.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La exención de dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.

Reimpresiones y permisos

Chen, C., Lin, LY., Chen, JW. et al. La supresión de CXCL5 recupera la neovascularización y acelera la cicatrización de heridas en la diabetes mellitus. Cardiovasc Diabetol 22, 172 (2023). https://doi.org/10.1186/s12933-023-01900-w

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Recibido: 13 de mayo de 2023

Aceptado: 22 de junio de 2023

Publicado: 07 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12933-023-01900-w

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